[发明专利]一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及发光细菌检测技术领域，特别涉及一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法。

背景技术

发光细菌是一种广泛存在的能发出蓝绿色可见光的细菌，其主要分布在海洋中，或者自由生活，或者寄生于海洋或陆生动物体。

发光细菌的发光过程是一种光呼吸过程，是电子传递链上的一个侧支，还原型的黄素单核苷酸(FMNH₂)充当反应的底物，萤光酶起催化作用，长链脂肪醛起作改变萤光酶构造的“修饰”作用。萤光酶通过分子氧催化(FMNH₂)和脂肪醛(RCHO)的氧化，这种氧化还原反应结果便产生磷光，波长465～490nm之间较多。

外界环境条件如pH、温度、氧浓度的变化都会影响发光细菌的发光强度；而有毒的化学物质，如重金属离子、抗生素、化学治疗剂、农药等同样会影响发光细菌的发光状况，因此，采用发光细菌作为敏感指标物测定抗生素类污染物的生物毒性在科研实践中是可能的。

经过几代科学家的努力，已成功提取和培养出发光细菌制剂并研制出与之配套的现代光电检测设备，从而形成了成熟的发光细菌毒性检测体系和方法。与传统的生物毒性实验相比，发光细菌毒性实验反应时间短、灵敏度高，并且由于是用发光量定量表征污染环境的生物监测方法，因而能够对环境的变化做出快速反应，有助于对环境质量进行综合评价。

标准的发光细菌急性毒性实验因其作用时间短，仅仅适用于那些快速表现出毒性的化合物的测定，对于测定那些影响生物生长繁殖过程的化合物的毒性，实验历经时间必须超过细菌的世代时间。抗生素类物质因其特殊的作用机制(主要是干扰转录、蛋白质的合成以及繁殖过程)，单纯依据标准发光细菌急性毒性实验方法获得的结果可能会严重低估抗生素类污染物的生物毒性。标准毒性实验结果主要反映细胞内部能量状态的变化，影响细胞物质合成的化合物的毒性在这么短的时间里变化很小，因此检测结果并未反应真实的状况。

此外，标准的发光细菌急性毒性实验仅适用于可溶性的有毒有害物质的检测，对不溶或微溶化学物质的检测未作详细的规范指导，使得其应用范围受限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用更加广泛和准确的发光细菌检测抗生素类毒性的改进方法，解决了现有技术中无法检测抗生素类污染物的延迟毒性、对不溶或微溶化学物质检测不精确等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：一种用发光细菌对抗生素类物质毒性进行检测的方法，包括如下步骤；

1)配制抗生素母液并将母液稀释至实验所需浓度；

2)制备发光细菌冻干粉复苏液；

3)空白对照制备：对于溶解性的抗生素，将发光细菌复苏液作为空白对照；对于不溶或微溶性的抗生素，将含有与对应待测样品具有相同含量二甲基亚砜的复苏液作为空白对照；

4)待测样品溶液制备：取不同浓度的待测样品加入到干净的测试管中，摇匀；

5)将空白对照和待测样品相间放置于测试架上；

6)按顺序向各个测试管中加入复苏的发光细菌冻干粉(根据发光量和仪器要求调节加入量)，两管加入时间相隔15-30s，轻轻振荡，使之均匀，

7)EC50值的计算：以待测样品浓度的对数为横坐标，对应的相对发光率为纵坐标作图，求得其EC50值，即相对发光率在50％的样品的浓度；

其特征在于，所述步骤6)的放置后，向各个管中按比例依次加入发光细菌的完全培养基，使抗生素类物质与发光细菌作用时间延长至12-36h后在水质毒性检测仪测定发光量。

优选地，所述抗生素类物质与发光细菌作用时间延长至24个小时。

优选地，抗生素类物质与发光细菌在20-25℃条件下培养。

优选地，所述抗生素类物质，包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、林可酰胺类。

优选地，所述抗生素类物质，包括四环素类和磺胺类抗生素。

优选地，所述四环素类抗生素，具体包括四环素(CTC)、土霉素(OTC)或金霉素(TC)、强力霉素。

优选地，所述的抗生素类物质为不溶或微溶物质时，在配置的抗生素类母液中加入二甲基亚砜，加入量不超过总体积的千分之一。

实验证明少量的二甲基亚砜对发光细菌的发光量不产生影响，而且采用二甲基亚砜溶解不溶或微溶抗生素类物质后，再将不溶或微溶抗生素毒性物质制成溶液后进行实验，扩大了发光细菌的应用范围。