[发明专利]在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白的表达和纯化方法，更具体地说，涉及一种采用麦芽糖结合蛋白/多聚组氨酸二元标签表达系统在大肠杆菌中表达和纯化得到水通道蛋白AqpZ的方法。

背景技术

水分子的跨膜运输是生命的基本活动之一。水分子快速的跨膜运输是生物体得以迅速地适应细胞外环境渗透压变化的一个重要的因素。水通道蛋白Aquaporins是重要固有蛋白的重要成员之一。它是水分子进出细胞专一性的跨膜通道，因此在维持细胞内环境稳态发挥着重要的作用。水通道蛋白遍布整个生物界，从原核细菌到真核动植物都有水通道被鉴定出来。大肠杆菌水通道蛋白Aquaporin Z (AqpZ) 是第一个被发现的原核生物水通道蛋白。由于AqpZ的发现，一系列新的水通道蛋白家族成员也被陆续解析出来。所以水通道蛋白AqpZ 已经成为研究微生物水分子运输、生物物理，生理及结构的模式蛋白。 AqpZ 的分子晶体结构已经被逐步的解析清楚。 AqpZ是由具有6个跨膜区域，5个相互连接的环和2个保守的NPA box (asparagines-proline-alanine) 装配而成的。AqpZ的高度疏水性，经过强烈的压缩之后形成了高度稳定且具有SDS抗性(SDS-Resistance)。在中性条件下，即使1% 的 SDS也不能使它解聚。在功能上，AqpZ对水有极高的渗透性，且该过程所需活化能很低，而且AqpZ是个“纯”的水通道蛋白，不能够运输甘油和尿素等一些小分子。研究表明重整到脂质体后，AqpZ表现出高度渗透系数（P_f=10*10^-14 cm³s^-1subunit^-1）和低的渗透活化能 (Ea=3.8 kcal/mol)。以此速率，大约0.14μg水通道蛋白AqpZ就能回收2.4升的废水（每个人每天最低需水量）。由于 AqpZ结构和功能上的优势，已被选作制备生物仿生复合膜的候选蛋白之一。但是缺乏有效手段获得足够量的AqpZ蛋白样品已成为该技术的主要瓶颈之一。主要由于AqpZ蛋白强烈的疏水性，它在细胞内的大量表达会造成细胞毒性，影响宿主细胞的正常代谢，因此其表达水平受到大大的限制，AqpZ在大肠杆菌体系的表达量仅仅只有2.5 mg/L。有研究表明采用融合表达策略可以大大提高AqpZ的表达水平，但是大部分蛋白都是以包涵体形式存在，仍然不能大量获得具有生物功能的AqpZ。主要的原因是亲水性标签还不能够完全中和AqpZ强烈的疏水性。因此，很难满足结构学研究和制备基于水通道蛋白的水回收装置的要求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，它包括以下步骤：

（1）大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS的扩增：根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物，通过设计引物在AqpZ基因的3'端人为的添加8个HIS亲和标签，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；根据pMAL-p2和pMAL-c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上Bam HI和Sal I限制性内切酶位点以适用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分别加上Bam HI和Hind III限制性内切酶位点以适用于pMAL-c5e，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA

（2）重组表达载体的构建：将步骤1得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL-p2和pMAL-c5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元标签重组表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS及 pMAL-c5e-AqpZ-HIS；将这两个二元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定；