[发明专利]在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

（1）大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS的扩增：根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物，通过设计引物在AqpZ基因的3'端人为的添加8个HIS亲和标签，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；根据pMAL-p2和pMAL-c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上Bam HI和Sal I限制性内切酶位点以适用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分别加上Bam HI和Hind III限制性内切酶位点以适用于pMAL-c5e，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA

（2）重组表达载体的构建：将步骤1得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL-p2和pMAL-c5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元标签重组表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS及 pMAL-c5e-AqpZ-HIS；将这两个二元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定；

（3）工程菌株的构建及诱导表达：将步骤2鉴定正确的的质粒转化到大肠杆菌表达宿主Rosetta (DE3)中，并接种到含有100 μg/mL 氨苄霉素和34 μg/mL 氯霉素的LB培养基中，在200-250转/分钟转速、30℃下培养过夜，得到种子液；然后，把种子液接种到SOC培养基摇瓶中，种子液与SOC培养基的体积比为l:50，在200-250转/分钟转速、30℃下培养至OD600为1.5时加入IPTG至IPTG的摩尔浓度为0.6 mM，并继续诱导培养8小时，然后5000转/分钟离心10分钟收集菌体，即得到超表达水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体；

（4）超声波破碎步骤3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，12000转/分钟离心10分钟后收集上清；

（5）纯化步骤4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。

2.根据权利要求1所述大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步骤（5）具体为：向上清中加入Triton X100至Triton X100的体积百分比浓度为4%， 室温振荡1小时，12000转/分钟离心30分钟后收集上清；上清上样于用平衡缓冲液平衡好的Co²⁺-NTA亲和层析柱后，再用平衡缓冲液平衡，冲洗，最后用洗脱液洗脱结合到Co²⁺-NTA亲和层析柱上的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS；采用脱盐柱G10将纯化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的缓冲液置换到factor Xa工作缓冲液或肠激酶工作缓冲液中，加入肠激酶或factor Xa在20℃酶切10小时；将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，再次上样于用平衡缓冲液平衡好的Co²⁺-NTA亲和层析柱，再平衡，冲洗最后用洗脱液洗脱结合到Co²⁺-NTA亲和层析柱上的AqpZ-HIS，得到高纯度的水通道蛋白AqpZ-HIS。

3.根据权利要求1所述大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步骤（5）具体为：向上清中加入Triton X100至Triton X100的体积百分比浓度为4%， 室温振荡1小时，12000转/分钟离心30分钟后收集上清；加入肠激酶在20℃酶切20小时；将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，上样于用平衡缓冲液平衡好的Co²⁺-NTA亲和层析柱，再用平衡缓冲液平衡，冲洗，最后用洗脱液洗脱结合到Co²⁺-NTA亲和层析柱上的AqpZ-HIS，得到高纯度的水通道蛋白AqpZ-HIS。