[发明专利]一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域中测定酶活性的方法，尤其涉及一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法。

背景技术

纤维二糖脱氢酶（Cellobiose Dehydrogenase，CDH）是一种双辅助因子的黄素血红素蛋白。CDH是很多木质纤维素降解真菌在纤维素降解条件下产生的细胞外酶，它可以氧化纤维二糖和纤维寡糖生成相应的内酯，同时利用糖所衍生的电子还原醌、苯氧自由基等。CDH具有较宽的底物范围，在以纤维二糖为电子供体时，可以还原多种电子受体，如醌、细胞色素c、三碘离子，Fe³⁺及O₂等。CDH被认为可以通过还原Fe³⁺和O₂生成Fenton试剂来氧化降解纤维素，同时由于CDH还可以还原木质素相关的醌和苯氧自由基，从而可以阻止木质素降解酶在氧化木质素时生成的自由基的再聚合反应。因此CDH被认为是连接纤维素降解和木质素降解的关键酶，在木质素降解中起重要作用。

纤维二糖脱氢酶的研究日益受到重视，不仅因为该酶独特的性能及结构，更在于它在木质素降解方面的大规模应用前景。然而目前研究较多的产CDH的黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）产量较低，限制了其应用。因此，菌种产酶条件的优化研究成为热点，而建立一种能快速、灵敏地检测CDH活性的方法不仅能协助菌种产酶条件的优化，还能进一步拓宽该酶的应用范围。

目前，对于CDH活性的检测普遍采用测定CDH对3,5-二叔丁基-1,4-苯醌或者对2,6-二氯吲哚酚钠（DCIP）的还原消耗。而许多产CDH的木素降解菌会同时产其它木素降解酶而影响对CDH活性的检测，例如漆酶（Laccase）的存在会重新氧化DCIP被CDH还原后的产物，从而降低了CDH活性的检测精确度。此外，其它被报道的CDH活性的检测方法（如细胞色素c还原法）的检测精确度也受上述因素干扰。据此，研究一种能克服其它堆肥功能酶干扰的纤维二糖脱氢酶活性检测方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种灵敏度更高、抗干扰能力更强的检测纤维二糖脱氢酶活性的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，包括以下步骤：

（1）纳米金颗粒的制备：取HAuCl₄水溶液加热搅拌至沸腾，然后边搅拌边加入柠檬酸钠溶液，直至混合溶液颜色转为清亮橘红色后停止加热，继续搅拌，室温冷却，得含纳米金颗粒的溶液；

（2）检测体系的制备：将上述含纳米金颗粒的溶液加入到缓冲溶液中（该缓冲液优选为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液），再加入纤维二糖溶液、氯金酸溶液和表面活性剂溶液，调节混合溶液中各组分的浓度，使所述纳米金颗粒、纤维二糖在混合溶液中的浓度分别控制在0.3nM～0.4nM和0.4mM～0.5mM（氯金酸和表面活性剂的浓度可由本领域技术人员根据实际情况在较大范围内进行调整，无特别要求，但氯金酸的浓度优选为0.2mM，表面活性剂的浓度优选为2mM），配得检测体系；

（3）酶活测定：将待测溶液按照1∶（4.5～5.5）的体积比添加到所述的检测体系中，混合均匀，待充分反应完全后，用紫外可见分光光度计对反应后的产物体系进行光谱扫描，测得产物体系中纳米金颗粒的表面等离子体共振吸收峰强度，再根据测得的表面等离子体共振吸收峰强度数值和已经建立的线性回归方程，得到待测溶液中纤维二糖脱氢酶的酶活。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述检测体系中，所述纤维二糖、氯金酸和纳米金的摩尔比优选为（2～2.5）∶1∶（1.5×10^-6～2×10^-6）。一般而言，检测体系中所述（柠檬酸-柠檬酸钠）缓冲溶液浓度优选为0.1mol/L。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述酶活测定步骤中，所述反应的测定条件优选为：反应温度控制在30℃～37℃，反应pH值为4.5～5.0，反应时间为10min～15min。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法，所述表面活性剂优选为十六烷基三甲基氯化铵（简称，CTAC）。

上述检测纤维二糖脱氢酶活性的方法优选应用于检测黄孢原毛平革菌培养后产出的粗酶液，即所述待测溶液优选为黄孢原毛平革菌培养后产出的粗酶液。