[发明专利]用于研究microRNA与靶基因5’非编码区相互作用的载体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，可用于不同类型microRNA与靶基因5′非编码区相互作用的研究。 

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，其前体结构是具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA，在细胞质中经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用^[1-3]。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达^[2]。随着miRNA调控基因表达研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。 

传统观念认为，miRNAs主要通过其“种子序列”，特异性地结合到靶标mRNA的3′非翻译区(3′UTR)抑制基因的翻译或者导致mRNA的降解。但是，在2005年，斯坦福大学医学院的研究人员发现了肝脏特有的miR-122与肝炎病毒mRNA 5′UTR相互作用引起病毒增殖，这项研究首次发现在动物细胞中，miRNA可以和5′UTR相互作用^[4]。同年，IBM科学家建立了一个数学模型，“预言miRNAs标靶超越了3′UTR的局限，是大范围存在的”。 

目前，市场已有专门用来检测miRNA与靶基因的结合活性，但主要集中在对3′UTR研究的报告基因载体系统，如pmiR-RB-Report^TM报告基因检测系统。该报告系统包含SV40启动子驱动的报告荧光基因(hluc)，其下游构建了靶基因3′UTR，通过对该荧光的监测，即可验证miRNA对该靶标是否有调控作用；另有一校正荧光基因(hRluc)用于监测转染效率，靶标表达效率，可作为稳定内参^[5-9]。 

本发明主要以抑癌基因p53为例，将p53mRNA的5′UTR序列克隆在荧光报告基因或绿色荧光蛋白(GFP)的上游，并在p53两侧添加1个酶切位点，便于将p535′UTR替换，研究其它的基因的非编码区与miRNA的作用。 

发明内容

本发明提供研究miRNA与靶基因5′UTR相互作用的分析系统。即可使用双荧光报告基因分析系统，酶切替换后也可使用绿色荧光蛋白的分析系统作为内参对照。 

本发明采用含有双荧光素酶报告基因(荧光素酶hluc及海肾荧光素酶hRluc)的质粒 pLuc，经过酶切、纯化、重叠PCR扩增、连接、转化，将p53-5′UTR序列克隆到pLuc质粒hluc区域ORF的上游，并在p53-5′UTR的PCR引物两侧设计两个酶切位点，将其质粒命名为pLuc-p53-5′UTR。同时，为了适应不同的需要，PCR扩增绿色荧光蛋白序列，双酶切pLuc-p53-5′UTR质粒的Rluc区，将绿色荧光蛋白序列替换Rluc区域，将其质粒命名pGFP-p53-5′UTR，该质粒载体进行细胞活体研究。同时，采取同样的方式，我们还可以得到pYFP-p53-5′UTR或者pCFP-p53-5′UTR的报告基因分析系统，扩大了研究的范围。 

本发明主要涉及miRNA靶标的研究。设计围绕研究miRNA与靶基因的5′UTR相互作用。因为p53-5′UTR区两侧有酶切位点，可以进行酶切替换，增加miRNA靶标研究的广泛性及灵活性。 

附图表说明 

图1pLuc-p53-5′UTR质粒图谱构建示意图 

图2p53-5′UTR的PCR扩增结果图 

Mr 100bp DNA ladder 

1.无模板的阴性对照 

2.p53-5′UTR的PCR产物 

图3pLuc质粒上HindIII和SpeI之间的序列PCR扩增结果图 

Mr 100bp DNA ladder 

1.pLuc质粒上HindIII和SpeI之间的序列的PCR产物 

2.无模板的阴性对照 

图4重叠PCR扩增结果图 

Mr 100bp DNA ladder 

1.无模板的阴性对照 

2.重叠PCR的PCR产物 

具体实施方式

本发明所述，包括酶切、回收、PCR扩增、连接、转化、测序等几个步骤。 

以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式，而不是以任何方式限定本申请的范围。