[发明专利]生产乙醇的基因工程微生物

说明书

技术领域

本发明涉及可再生能源和生物技术领域。具体涉及一种经过基因工程修饰后可通过光合作用高效生产乙醇的微生物，以及所述基因工程修饰微生物的方法和运用此基因工程微生物制备乙醇的方法。 

背景技术

进入21世纪以来，原油价格居高不下，太阳能、风能、潮汐能等开发利用成本居高不下，而各国对环境保护的要求在不断的提高，因此，如何开发替代能源的问题受到各国普遍关注。许多国家将加快发展可再生能源作为发展替代能源的重要战略，生物能源是其中发展最快的领域。 

目前的液体生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速发展面临着粮食安全和土地淡水资源紧缺问题。现有技术通过燃料乙醇产业作为替代能源，但是，随着燃料乙醇产量增加，粮食供给短缺和价格上涨导致以粮食为原料的生物能源产业不能持续性发展。 

近几年大力发展的非粮燃料乙醇和生物质发电产业同样受到客观条件的制约，难以满足大规模替代化石燃料的规模和成本要求。以木薯、甜高粱、纤维素为原料的燃料乙醇产业从本质上说是以种植业为基础的，需要大规模投入可耕地、淡水、化肥以获得较高产量，而这些资源均为稀缺资源，用于替代化石能源将对整体资源环境造成巨大压力。 

因此，迫切需要开发不占用可耕地、淡水、化肥资源的新型生物能源技术，为可再生能源产业发展提供具备现实可行性的手段，切实有效减少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促进基于化石能源的传统工业体系向基于可再生能源的绿色工业体系转化。 

对微生物进行基因工程改造来生产能源是能源产业中的一个发展方向。但现有技术中，工业上主要是利用具有乙醇代谢途径的异养微生物，例如酵母和大肠杆菌等。 

发明名称为“基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法”的中国专利200480019052.8公开了用外源木糖异构酶基因转化酵母细胞。额外的基 因修饰增强了所转化的细胞将木糖发酵成乙醇或者其产物的能力。那些修饰包括缺失非特异或特异的醛糖还原酶基因、缺失木糖醇脱氢酶基因和/或超表达木酮糖激酶。该方法可用于燃料乙醇的生产或用于酒精饮料的生产。 

发明名称为“大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用”的中国专利200710177003.2公开了一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。经多代的定向筛选得到了高耐乙醇的大肠杆菌突变株，并在所述突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因II和丙酮酸脱羧酶基因，得到了一种新型耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。该工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时，在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇转化率。 

蓝藻是一种自养微生物，是目前地球上最广泛的生物体。蓝藻的细胞质中都有内膜系统。蓝藻的细胞质中具原始的片层结构，片层上分布有光合色素叶绿素和藻胆素(包括藻蓝素和藻红素两种)及类胡萝卜素。蓝藻的叶绿素可以进行光合作用，并且其细胞可以提供光合作用所需的能量，所以蓝藻可以进行光合作用，产生自己所需要的物质，即可以自养。 

但是，自然存在的光合细菌蓝藻通常不能利用阳光和二氧化碳合成乙醇，仅在避光和无氧条件下通过发酵产生少量乙醇。 

本领域已知生产乙醇的微生物(例如大肠杆菌，酵母菌，运动发酵单细胞菌等)中存在乙醇生产的代谢途径。已知的乙醇生产代谢途径是从糖酵解途径的丙酮酸经过乙醛再到末端代谢产物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反应过程由丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化，乙醛到乙醇的反应过程由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase 2，ADHB)催化控制。蓝藻的基因组中不存在丙酮酸脱羧酶基因pdc，因而不具有利用阳光和二氧化碳产生乙醇的能力。 

本发明提供了一种利用基因工程蓝藻生产乙醇的方法，经过对野生蓝藻的改造，从而使得蓝藻能够直接利用太阳光和二氧化碳生产乙醇。 

发明内容

本发明以蓝藻为宿主，将丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因导入蓝藻，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株，使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本发明还提供了基因工程蓝藻通过光合作用利用阳光、水和二氧化碳制备乙醇的方法。由于宿主蓝藻没有丙酮酸脱 羧酶基因，因此所述丙酮酸脱羧酶基因是外源的乙醇代谢途径的丙酮酸脱羧酶基因。