[发明专利]快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及了一种快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法。

背景技术

PCR技术已广泛应用于病原菌的诊断，具有灵敏度高、特异性强的优点。自然标本中因含有大量的杂菌及异物（包括PCR反应抑制物），对自然标本中特定病原菌的检测，一般先使用针对该病原菌的特定培养液进行增菌培养，或使用平板（鉴别）培养基进行培养，然后取增菌液或挑取平板培养基中疑似的病原菌菌落，制备PCR反应模板，进行PCR检测。由于自然标本中存在PCR反应抑制物，因此不宜省略增菌培养或鉴别培养的步骤。在整个检测过程中，增菌培养及平板（鉴别）培养耗时费力。

本研究以磁性细菌由来的磁珠（bacterial magnetic particles， BMPs）为载体^[1、2]，合成免疫BMPs^[2、3]，使用免疫BMPs，直接对粪便标本中的大肠杆菌O157进行捕获、分离和洗净，不进行增菌培养及平板（鉴别）培养，探讨快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法。使用免疫BMPs快速纯化细菌PCR反应模板，旨在缩短检测时间，去除自然标本中存在的PCR反应抑制物等影响检测的成分。同时，也可以考虑应用于某些在人工培养基中培养困难的病原菌的PCR反应模板的制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，缩短了检测时间，利用免疫BMPs捕获自然标本（粪便）中的目标病原菌，通过分离和洗净，去除标本中存在的PCR反应抑制物等影响因素，可省略增菌培养及鉴别培养，快速纯化目标病原菌的PCR反应模板的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

快速纯化及制备细菌PCR反应模板的方法，包括以下步骤：

步骤a：牛粪便标本中添加PBS溶液5 mL，混匀，1000 r/min离心30 s，去除大颗粒的杂质；

步骤b：向含菌的牛粪稀释液中添加免疫BMPs 0.3 mg，混合均匀，反应30 min后进行磁性诱导，从牛粪中分离出磁性凝集物；

步骤c：分离出来的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3次，清洗后，添加灭菌双蒸水100 μL，分散，重新振荡悬浮后至95℃加热5 min；再经12000 r/min离心5 min；

步骤d：回收上清液，制得PCR反应模板。

作为优选，所述的PBS溶液的ph值为6.8。

作为优选，所述的磁性诱导采用普通磁石进行诱导。

作为优选，所述的牛粪便标本中的大肠杆菌O157浓度为1～10⁴ cfu/g。

BMPs系稳定的单磁畴晶体，不同于一般合成磁珠的多磁区构造，在溶液中分散性能明显优于普通铁氧体磁珠，反应表面积相对稳定，检测的敏感性及稳定性较好^[1、2]。另外，通常在人工合成的无机磁珠表面进行生物包被或修饰后稳定性欠佳，而BMPs能改善这一现象，大量实验结果均表明修饰后免疫BMPs的稳定性及可操作性良好^[2、4、5]。

本研究的结果表明，对于大肠杆菌O157浓度为1～10⁴ cfu/g的牛粪便标本，使用免疫BMPs处理后制备PCR反应模板，PCR检测结果，与通过增菌及平板培养后制备PCR反应模板，检测结果一致。表明使用免疫BMPs，可以直接对粪便标本中的大肠杆菌O157进行有效捕获、分离和洗净，可省略常规的增菌培养及平板（鉴别）培养，快速纯化细菌的PCR反应模板。在大肠杆菌O157浓度低于10³ cfu/g时，经免疫BMPs处理后制备PCR反应模板、及通过增菌和平板培养后制备PCR反应模板，比粪便标本直接制备PCR反应模板，PCR检测的敏感性明显增高。

美国农业部动物排泄物病源菌研究实验室的Shelton等^[6]报告了一种快速定量及确定自然水体和人工水体中存在的大肠杆菌O157的方法， Shelton等的方法是将大肠杆菌O157的单克隆抗体吸附到人工合成的磁颗粒上，使其与病菌结合，磁性分离后进行培养检测。这种方法可以检出100 mL水中含有的数个大肠杆菌O157，这一方法有助于卫生机构对公共水上场所进行检查。