[发明专利]一种针对hNINL基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其制备

说明书

技术领域

本发明属分子生物学，生物医药及基因工程技术领域，主要涉及针对hNINL(humanNinein-like)基因的RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-hNINL)及其制备。

背景技术

肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生和凋亡不足而形成的局部肿块。在体内外致瘤因素作用下，细胞的基因发生突变，导致正常细胞转变为肿瘤细胞，形态、功能和代谢发横异常，因而获得了新的生物学特征。

从细胞水平上看，癌的发生是极偶然的事件。从遗传上看，癌都是由一个细胞发展而来，由一个失去了增殖控制的细胞发展而来。人体有百万兆的细胞，每天都有几十亿个细胞进行分裂，理论上几乎任何一个细胞都有可能由基因突变而癌变，但实际上，肿瘤发生是一个渐进式的过程，涉及多级反应和突变的积累。在此过程中，癌变的细胞系越来越不受体内调节机制的控制，并逐渐向正常组织侵染。在细胞发生恶性转变之后，癌细胞继续积累突变，赋予突变细胞新的特性，使癌细胞更具危险性。

BRCA1基因编码一个分子量为220kD的大蛋白，该蛋白有多个功能区，可与许多重要蛋白结合，如癌基因蛋白(c-Myc，E2F)，抑癌基因蛋白(p53，Rb，BRCA2，ATM)，DNA修复相关蛋白，细胞周期调节蛋白以及转录调节因子等。BRCA1不仅能抑制细胞生长，还参与细胞周期调控，基因转录调节，DNA损伤修复以及凋亡等多种重要细胞活动，在维持基因组稳定性中起重要作用

Bacp/Nlp(BRCA1 associated centrosome protein/Ninein-like protein)蛋白由Ninein-like(NINL)基因编码，是一个与BRCA1存在共定位的新蛋白，并且同γ-tubulin共定位于中心体。研究显示，Bacp/Nlp蛋白在体内外实验中均能募集γ-TuRC(tubulin ring complex)成分γ-Tublin及hGCP4，提示该蛋白可能作为一个候选的GTBp(γ-Tublin complex binding protein)成员。同时，Bacp/Nlp促进微管晶核形成，其在有丝分裂期从中心体解离对于纺锤体的形成是必须的，说明该蛋白在染色体的正常分离以及胞质分裂中起着重要作用。

与正常组织相比，人类乳腺癌、肺癌等肿瘤组织中广泛存在Bacp/Nlp蛋白的过表达现象，当Bacp/Nlp蛋白的表达被siRNA抑制后，细胞可以出现多个中心体的现象，而且胞质分裂受到抑制不能完成，导致细胞含有多个细胞核；而用Bacp/Nlp高表达的NIH3T3细胞在裸鼠进行注射后，可以导致裸鼠成瘤。这些发现提示，Bacp/Nlp蛋白可能在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要的作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。