[发明专利]一种用脂质体技术筛选乳杆菌冻干用保护剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂质体制备和微生物领域。

背景技术

冷冻干燥是将欲保藏的微生物细胞在真空条件和冻结状态使冰升华，最后达到干燥。其步骤分3步进行，首先是预冻过程，预冻的速度与温度根据微生物的种类而定。其次是升华过程，将预冻好的微生物置于高真空度的环境中，冰晶吸热而直接变成水蒸气从微生物体内溢出。升华过程是由内向外逐渐推移的，冰晶升华后在微生物体内留下许多微孔隙。再次是解析过程，这一过程使残留在微生物体内的结合态水解析出来，进一步降低微生物体内水分的含量。

乳酸菌是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。大量研究表明乳酸菌是一类对人体健康有利的益生菌。乳酸菌产品逐渐受到人们的重视，于二十世纪七十年代初期开始研制真空冷冻干燥发酵剂。冷冻干燥过程会造成乳酸菌的细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH值的动态平衡被破坏、DNA损伤和膜脂肪酸组成发生改变等。会使部分细胞损伤，甚至死亡。

β-半乳糖苷酶是乳酸菌发挥其益生菌功能的重要酶类，它能消化乳糖，使患有乳糖不耐症的人群能够充分吸收它。有关研究乳酸菌的冷冻损伤发现：正常菌体上清液、菌体悬浮液中相对β-半乳糖苷酶活力分别为0、32.9％，冻藏菌体为0.28％、48.9％，而冻干菌体则为0.95％、60.8％，这表明细胞膜的通透性增加，使β-半乳糖苷酶从细胞内泄漏出来。此为冻干带来的细胞膜损伤。通常细胞膜中磷脂的极性端在一定程度上是以水合形式存在的，而且每个磷脂的极性端与其它磷脂分子的极性端被水分子隔开。当磷脂干燥脱水时，极性端的密度增加，糖链间的范德华引力增强，平时处于液晶态的脂膜变成凝胶态，相的变化使复水时细胞膜的通透性增加，胞内一些可溶性物质发生渗漏，从而导致细胞死亡。微生物细胞的干燥损伤很大程度是由于膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性改变，从而导致膜的功能失调，影响微生物的生命活动。

脂质体具有类似生物膜的双分子层结构囊泡。天然磷脂化合物依靠疏水相互作用构成生物膜的基质。当前常用的模拟膜体系有Langmuir膜，平面双层脂膜和脂质体。脂质体可以分为单层小泡囊(SUV).单层大泡囊(LU.V)和多层大泡囊(MUV)，都是包结着水室的封闭双层结构，是最接近于细胞的模型。脂质体适合用于膜渗透的测量。

脂质体可长时间吸附于靶细胞周围，使药物充分被靶细胞、靶组织吸收。将药物做成脂质体后，具有靶向性、缓释性、组织相容性与细胞亲和性、降低药物毒性、提高药物稳定性等特点。脂质体作为新型的药物剂型可以达到提高药品安全性、有效性、稳定性和患者顺应性，降低药品不良反应的目的，所以日益受到国内外医药界的广泛重视。

本发明结合脂质体技术筛选乳酸菌冻干保护剂。目前为止发现的乳酸菌的冻干保护剂有数十种。如甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖、透明质酸等。筛选保护剂的方法主要是采用传统的菌体培养法，比较冻干前后活菌数、酶活力等指标的变化，耗时长，操作要求高。本发明以脂质体模拟瑞士乳杆菌9的细胞膜，并在脂质体中包封β-半乳糖苷酶，观察冷冻干燥对脂质体包封酶量及瑞士乳杆菌9胞内酶变化之间的关系，证实脂质体技术可以用于快速筛选冻干保护剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种简单快速筛选乳杆菌冷冻干燥保护剂的方法。

利用脂质体技术筛选保护剂的主要实验步骤

(1)β-半乳糖苷酶脂质体的制备

①称取大豆卵磷脂和十八胺按摩尔比10∶1，共144μmol，溶于15ml乙醚中。

②吸取5ml β-半乳糖苷酶酶液，其蛋白质浓度为1.286mg/ml，酶的比活力为1970U/mg蛋白质。加入①中混匀。水浴超声3min，每处理30s，间歇30s，使之成为油包水型，即W/O型乳液。

③旋转蒸发，除去有机溶剂

④加入外水相。加入磷酸钠缓冲液(20mM，pH7.0)30ml，继续旋转直至白色悬液形成

⑤超声破碎仪匀化粒径。超声功率为80％，超声时间为5min×2，至形成透亮的溶液。所制备的脂质体平均粒径：脂质体平均粒径：110nm～150nm，分散性指数(PdI)：0.265～0.390，Zeta电位：-37.1～-42.0mV。

(2)脂质体与游离β-半乳糖苷酶的分离以及测定脂质体包封率