[发明专利]用于华法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒及其PCR扩增方法

说明书

本申请是申请日为2010年7月23号，申请号为201010234597.8，名称为“一种用于华法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒及其PCR扩增方法”申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及一种用于华法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒及其PCR扩增方法，特别涉及一种检测影响临床华法林用药剂量的维生素K环氧化物还原酶复合物1基因VKORC1(-1639G/A)与细胞色素P450酶2C9基因CYP2C9(1075A/C)的单核苷酸多态性(SNP)的试剂盒以及PCR扩增方法，属于生物医学领域中的临床检测技术。 

背景技术

华法林是临床上广泛使用的一种双香豆素衍生物类口服抗凝药，通过干扰环氧化型维生素K与氢醌型维生素K之间的转化循环而产生抗凝效应。主要用于预防和治疗血栓性疾病如血栓栓塞性静脉炎、肺梗塞、心房纤颤等，在外科心脏瓣膜置换术、血管移植术等术后也需要常规服用华法林，特别是人工机械瓣膜置换术后患者需终生服用。但华法林的有效治疗范围较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，除了受患者年龄、性别、体重、体表面积、营养状态、肝肾功能、饮食及使用药物等临床因素的影响外，华法林的靶酶VKORC1和用药剂量酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的主要因素，而当前确定华法林需求剂量时无法考虑遗传因素的影响，常常造成患者严重的出血并发症。 

华法林是维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的特异性抑制剂，VKOR主要由维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)基因编码，该基因位于染色体16p11.2，全长约4kb；VKOR可使无活性的环氧化型维生素K转变为有活性的氢醌型维生素K，氢醌型维生素K是γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)的必要辅助因子，凝血因子II、VII、IX、X、蛋白质C和蛋白质S经过GGCX的羧化作用后而活化，进而发生一系列级联反应引起血液凝固。大量研究发现，在VKORC1编码区和非编码区存在大量的多态性位点，其中VKORC1启动子的基因多态性(-1639G/A)是影响华法林需求剂量中种 族差异和个体差异的最主要因素，其机制是启动子多态现象改变了能够影响启动子转录活性的E-盒(CANNTG)共有序列。研究表明，G基因的VKORC1启动子活性比A基因的启动子活性高出44％。GG基因型的个体VKORC1启动子活性增高，引起VKORC1mRNA表达增加，VKOR生成也相应增多。VKOR增多，有活性的氢醌型维生素K生成和凝血因子生成也增加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效果；而启动子区域-1639G＞A的突变可引起VKOR mRNA的表达下降，从而使肝脏中VKOR的生成也相应地减少，进而引起环氧化型维生素K还原成氢醌型维生素K减少，此时只需要很少剂量的华法林就能达到抗凝效果，最终导致患者对华法林敏感；其中华法林敏感者(≤1.5mg/d)的基因型为纯合子AA，而华法林抵抗者(≥6.0mg/d)则为基因型AG或者GG。 

华法林在体内的用药剂量主要是通过肝脏细胞色素氧化酶P450(CYP)系，华法林含S型和R型2种异构体，S型主要经肝脏CYP2C9用药剂量，R型由CYP3A4用药剂量，其中S型华法林的抗凝活性比R型华法林强3～5倍，因此CYP2C9是影响华法林用药剂量的主要酶之一。CYP2C9是CYP系统的亚家族，该酶的基因位于染色体10q24.2上，全长约55kb，含有8个内含子，9个外显子(mRNA长1.47kb)，编码490个氨基酸残基、分子量为55kD的蛋白质，它是人类肝脏中一种重要的药物用药剂量酶，大约10％的临床常用药物由CYP2C9氧化用药剂量，人类的CYP2C9基因同样具有遗传多态性，其中与亚洲人群最为密切的是CYP2C9基因第7外显子的第1075位核苷酸存在A/C多态(1075A/C)，导致多肽链第359位氨基酸Ile被Leu取代，突变后其编码的酶活性比野生型降低了80％，导致CYP基因突变个体对华法林的用药剂量能力以及清除能力大大降低，从而导致患者对华法林敏感，携带CYP2C9突变基因的个体在使用华法林的初期就有较高的出血危险性。 

综上所述，VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9(1075A/C)基因多态性是导致华法林需求剂量民族差异和个体差异的重要因素；国人VKORC1(-1639)等位基因G和A频率分别为14％和86％，以AA和AG型为主，GG型少见；CYP2C9(1075)等位基因A和C频率分别为95％和5％，以AA和AC型为主，CC型罕见。因此，VKORC1(-1639)G→A、CYP2C9(1075)A→C的变异均可导致患者华法林用量的显著减少。