[发明专利]一种北方根结线虫LAMP快速检测方法及应用

权利要求书

1.一种北方根结线虫LAMP快速检测方法，以北方根结线虫DNA为模板，LAMP反应体系试剂中包括引物混合物、反应缓冲液和反应酶，所述引物混合物有如下引物：

①MHF3：5’-GAATATGAGGTGACATGTTAGG-3’，

②MHB3：5’-TCAATGTTTCTGCAGTTCG-3’，

③MHFIP：5’-TGAAAAAAATATTGCTGGCGTCCACCTTAATCGGGTTTAAGACT-3’，

④MHBIP：5’-TCTATCCTTATCGGTGGATCACTCCACAAATTATCGCAGTTAGCT-3’，

⑤MHLB：5’-GGCTCGTGGATCCATGAAGAACG-3’。

2.根据权利要求1所述的检测方法，所述引物混合液为：外引物MHF3和MHB3各0.2μmol/L，内引物MHFIP和MHBIP各1.6μmol/L，环引物MHLB为0.4μmol/L，所述反应缓冲液：6mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl的pH为8.8，10mmol/L KCl，5mmol/LMgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100；反应酶：8U Bst DNA聚合酶大片段。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于：在LAMP反应完的体系加入显色剂，观察显色情况。

4.根据权利要求3所述的检测方法，所述显色剂为SYBR green I。

5.根据权利要求1或2所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于：取LAMP扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带。

6.根据权利要求1或2所述的检测方法，还包括观察检测结果步骤，其特征在于：引物混合物中MHFIP或MHBIP的5’端带有生物素标记，在LAMP反应产物中加入20pmol/L的FITC标记的探针，63℃保温5min，冷却到室温，取8μL的杂交液加入100μl PBS缓冲液，将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中，通过观察LFD试纸上的条带，所述探针序列为：

MH-FITC-Probe：5’-CTCGTGGATCCATGAAGAAC-3’，MH-FITC-Probe的5’端用FITC标记。

7.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，所述LAMP反应条件：将引物混合液、反应缓冲液、反应酶混合均匀后加入1μl DNA模板后，61～65℃保温30～60min，82℃保温5min。

8.根据权利要求1所述的检测方法，所述北方根结线虫DNA的提取试剂组分配方如下：

1)WLB溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl₂，1.0mmol/L DTT，4.5％Tween20，等体积混匀，过滤灭菌；

2)蛋白酶K：20mg/mL蛋白酶K。

9.根据权利要求8所述的检测方法，所述北方根结线虫DNA的提取方法为：挑取单头根结线虫放入装有10μlddH₂O的0.2mL离心管中，加入8μl的WLB溶液，2μl蛋白酶K溶液，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融化后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min；将离心管转移到65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

10.权利要求1-9所述任一检测方法在诊断植物、土壤的北方根结线虫感染情况或鉴别北方根结线虫中的应用。