[发明专利]一种检测RET基因融合的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种检测RET基因融合的方法及其应用。

背景技术

癌症是目前威胁人类生命和健康的主要疾病，癌细胞在体内无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗，癌细胞也能释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；严重患者由于器官功能衰竭而死。

肺癌是目前全世界的最主要癌症，据统计，1995年全世界有60万人死于肺癌，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年。肺癌也是严重危害我国人民生命健康的重大疾病，目前每年我国肺癌的患病人数约120万/年。

已有研究揭示：肺腺癌病人中存在一个关键致病基因突变：RET基因融合。RET是一个受体酪氨酸激酶，在正常的肺组织中表达较低，而在肺癌样本中往往表达较高。研究表明，RET基因在肺癌样本中发生了基因的融合，该融合来源于染色体DNA水平的转位，可以造成相关蛋白(如KIF5B或CCDC6)的胞外域与RET的激酶活性区融合为一个新的蛋白。

RET基因融合对于具有RET基因融合的肺腺癌患者的“个体化”治疗具有直接的指导意义。目前已有几种可能的寻找新的RET基因融合的方法，如：通过全基因组测序(Whole genome sequencing)、转录组测序(Whole transcriptome sequencing)、下一代测序(Next generation sequencing)、或外显子芯片(Exon array)等方法对大量的候选基因进行筛选，然后用RACE和RT-PCR来逐一验证。这些方法不仅价格昂贵，还需要进行大量的验证工作来对候选基因进行确认，得到的结果十分粗略，准确度欠缺，因此不适用于临床检测。此外，Split FISH可通过识别RET基因前后两部分对应的信号点是否发生分离的方法来确定RET基因是否发生了融合，这种方法价格昂贵，检测成本高，病人经济负担重，同时也不排除基因融合可能会发生在同一染色体上较近的位置，此时Split Fish完全不能够检测。此外，还有利用跨融合位点的引物，用PCR检测样本中已知的RET基因融合，这种方法完全不能够检测未知的融合方式。

因此本领域目前还没有一种简便快捷、价格低廉、可操作性强的检测RET基因融合的方法。因此本领域迫切需要开发检测RET基因融合的方法

发明内容

本发明的目的就是提供一种检测RET基因融合的方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种检测待测样本中RET基因是否融合的方法，包括步骤：

(1)检测所述待测样本中RET基因转录本前部的相对表达量，记为PA₁，并检测RET基因转录本后部的相对表达量，记为PB₁，并计算两者的相对表达比率，记为P值：

(2)将待测样品的P值与RET基因未发生融合样本的P值进行比较，其中，如果待测样品的P值与RET基因未发生融合样本的P值存在显著差异，则表示待测样本中的RET基因存在融合。

在另一优选例中，所述的待测样本为mRNA或cDNA。

在另一优选例中，所述的P值为PB₁/PA₁。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：对P值存在显著差异的待测样品进行分析，从而确认RET基因的融合方式。

在另一优选例中，所述的分析包括：普通PCR，5’RACE和/或测序。

在另一优选例中，所述RET基因的融合方式为：RET基因发生融合的位置，和/或与RET基因发生融合的上游基因(Partner)。

在另一优选例中，所述RET基因未发生融合样本为：无肿瘤组织的正常样本，和/或没有RET基因融合的肿瘤组织样本。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌(如肺腺癌)肿瘤、或甲状腺癌肿瘤。

在另一优选例中，步骤(1)包括步骤：以cDNA样本为模板，用Real-Time PCR的方法，分别对RET基因转录本前部对应的cDNA序列和RET基因转录本后部对应的cDNA序列进行扩增，获得RET基因转录本前部的相对表达量和RET基因转录本后部的相对表达量。

在另一优选例中，上述的RET基因转录本前部对应的cDNA序列为：RET基因的第1外显子至第7外显子之间的cDNA序列。

在另一优选例中，上述的RET基因转录本前部对应的cDNA序列如SEQ ID NO.：5所示。