[发明专利]A型猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒

说明书

 

技术领域

本发明属于动物卫生检验技术领域，涉及一种核苷酸及其应用，更具体的说是一种A型猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒。

背景技术

猪流感（Swine Influenza ，SI）是由猪流感病毒（Swine Influenza Virus ，SIV）引起的一种急性、高度接触传染性的群发性呼吸道疾病，临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难为特征。该病传播速度快，在各年龄和各品系的猪中，发病率高达100%，对于免疫系统不完善的仔猪致死率较高。此外猪流感还可引起母猪繁殖障碍、育肥猪增重减慢等，对养猪业所造成的危害和经济损失巨大。猪流感自1918年美国首次报道以来，已造成世界范围内的多次大流行，迄今已遍及欧、美、亚、非、澳洲等世界各地。

猪流感病毒具有同时感染人和禽的能力，而且猪是对禽流感病毒和哺乳动物流感病毒均敏感的唯一动物，在流感病毒“禽-猪-人”的种间传播链中，充当了病毒重组及复制的“混合器”。2009 年3 月在墨西哥、美国等地暴发的A型流感病毒便是一种新型的变异病毒株，这种新型流感病毒包含人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。猪流感不仅给畜禽养殖造成重大经济损失，而且还对人类健康造成威胁，因此快速、敏感、准确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生意义。

核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。NASBA的简要过程如下：（1）RNA模板链进入反应混合物后，第一个引物首先与模板链的3'端结束。（2）反转录酶（AMV），合成反义的补偿的DNA链。（3）RNaseH，分解破坏RNA模板链。（4）第二个引物与DNA的5’端结合。（5）T7 RNA polymerase 合成RNA补偿链，并加入到步骤1中，使反应可以循环进行。

NASBA-ELISA方法是将NASBA 技术和ELISA (酶联免疫吸附剂测定)方法相结合，其原理是将地高辛标记到检测探针上，通过探针捕获探针将地高辛标记的探针和NASBA 产物的复合物吸附到微量反应板上，作用于底物硝基苯基磷酸盐显色，然后通过分析吸光度来检测RNA 产物。由于捕获探针和检测探针的应用，使检测结果更为特异，而酶标仪的高通量性能使一次能够检测多个样品。

猪流感病毒是负链RNA病毒，病毒基因组由8个分节段的RNA组成，其中核蛋白（NP）基因相对保守，且该基因具有种群和型的特异性，因此核蛋白经常作为流感病毒型的分类和诊断的候选基因。本发明以猪流感病毒NP基因作为目的基因，建立NASBA快速检测方法，用于猪流感病毒的诊断，提高我国猪流感诊断、疫情监测和检验检疫技术水平，保障养猪业的健康、快速发展。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测A型猪流感病毒的特异性探针。

本发明的另一个目的是提供一种检测A型猪流感病毒NASBA-ELISA的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种检测A型猪流感病毒NASBA-ELISA试剂盒的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性捕获探针和检测探针，其特征在于，所述的捕获探针序列如SEQ NO:1所示；具有如SEQ NO:2所示的检测探针序列。

本发明进一步公开了针对A型猪流感病毒的NASBA-ELISA试剂盒，它是由下述成分组成：

1）引物和探针 

引物NP-DET：2μl

引物NP-T7：2μl

捕获探针NP-CP：1μl

检测探针NP-DP：1μl

所述捕获探针NP-CP，具有如SEQ NO:1所示的引物序列；所述检测探针NP-DP具有如SEQ NO:2所示的引物序列。

2）NASBA扩增试剂

BA（缓冲液）：40mM/L  PH8.5 Tris-HCL，70mM /L KCl，12mM/L MgCl₂，5mM/L DTT                                                             4μl

DA：10mM/L dNTP                                                      2μl