[发明专利]A型猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒

权利要求书

1.一对针对A型猪流感病毒NP基因的特异性捕获探针和检测探针，其特征在于，所述的捕获探针序列如SEQ NO:1所示；具有如SEQ NO:2所示的检测探针序列。

2.一种针对A型猪流感病毒NP基因的NASBA-ELISA试剂盒，它是由下述成分组成：

1）引物和探针 

引物NP-DET：2μl

引物NP-T7： 2μl

捕获探针NP-CP：1μl

检测探针NP-DP：1μl

所述捕获探针NP-CP，具有如SEQ NO:1所示的引物序列；所述检测探针NP-DP具有如SEQ NO:2所示的引物序列；

2）NASBA扩增试剂

BA（缓冲液）：40mM/L  PH8.5 Tris-HCL，70mM /L KCl，12mM/L MgCl₂，5mM/L DTT                                                 4μl

DA：10mM/L dNTP                              2μl

NA：20mM/L NTP                               2μl

MA（酶混合液）：1~2UAMV， 0.2~0.5U RNaseH，30~50U T7 RNA 聚合酶，2~6μl 1mg/ml BSA                                              4μl

SA：DMSO                                        1μl

3）NASBA产物检测试剂

96孔酶标板：链酶亲和素包被的酶标板

杂交缓冲液：20×SSPE（ pH7.4），50mM/L Tris-HCl ( pH8.8)，1﹪BSA  43μl

酶标抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体                                          100μl

显色液：3mg pNPP溶于1mLddH₂O中，避光-20℃保存                  100μl

终止液：0.5M Na₂CO₃溶液                                                       100μl

洗液：PBST溶液（含0.05%Tween-20，pH7.2，PBS）                    450μl。

3.权利要求2所述针对猪流感病毒NASBA-ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征是包括下述步骤：

1）扩增反应体系： 3μl 待检样品RNA、4μl BA 、2μl DA、2μl NA、1μl SA、2μl引物NP-T7、2μl引物NP-DET；

2）NASBA扩增过程：65℃加热5min，41℃冷却5min，迅速加入4μl MA，41℃反应90min；4℃终止反应；

3）NASBA产物检测过程：

①在酶标孔中加入杂交缓冲液43μl、捕获探针1μl、检测探针1μl和NASBA产物5μl，震荡混匀，放入41℃温箱中反应1~2h；

②用每孔加入150μl洗液，室温放置3~5min，弃去溶液，反复洗板3次；

③每孔加入酶标抗体100μl，室温孵育30min，洗板3次；

④显色 每孔加入100μl显色液，室温避光显色10min；

⑤终止反应 每孔加入100μl终止液，在酶标议上测定405nm的OD值。

4.权利要求2所述试剂盒在制备A型猪流感病毒临床样品检测方面的应用。