[发明专利]一种连续流动巢式PCR微流控方法

说明书

技术领域

本发明属于微流控PCR分析与检测技术领域，特别涉及一种连续流动巢式PCR微流控方法。

背景技术

自从20世纪90年代初 Manz 和 Widmer 首次提出微型全分析系统概念以来，作为其核心技术的微流控技术已发展为当前世界上最前沿的科技领域之一。当前微型全分析系统的热点和重点应用领域主要集中在生命科学领域，微流控技术在促进分析仪器微型化、集成化、自动化和便携化方面的优势为其在生物医学、高通量药物合成筛选、环境监测与保护、卫生检疫、医疗保健诊断、法医鉴定以及生化战剂的侦测等众多领域提供广阔的应用前景。聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增DNA片段的方法，因其优异的灵敏度和特异性在生命科学以及诸多相关领域已经得到非常广泛的应用。因此，在微流控技术日益朝生命科学领域发展的过程中，微流控技术与PCR相结合以实现快速灵敏的分析检测是一种必然的发展趋势。

目前微流控PCR主要分为静态和动态两大类。前者实质为传统PCR热循环仪的微型化，由于微结构本身仍具有较大的热容而额外增加了变温过程中的热弛豫时间，因此PCR的快速性受到限制。后者利用“空间交换时间”让PCR反应液沿微通道连续通过两或三个恒温区来实现PCR所需的热循环，因此可快速变温而大大缩短循环总时间。微通道结构尺寸的缩小导致比面积大大增加，在提高导热和传质速率从而加快分析和处理的同时，也使得通道内壁与反应液中的生物分子的相互作用加剧，降低PCR的扩增效率，而动态微流控PCR由于反应液与通道接触面积的增加而表现得更加明显。为克服这些不足，一些新兴技术和方法近年来得到发展，比如降低反应通道与生物分子的相互作用而采用的通道内表面钝化处理、油包裹技术，但工艺流程复杂耗时，增加检测成本，或样品PCR后处理繁琐，操作不便，难以满足实际分析检测中低成本高效率的需求。

在针对实际生物样品核酸的检测与分析中，采用现有技术方法的微流控PCR的成功运用仍依赖于较高的初始核酸模板浓度，对于低丰度的核酸样品则面临检测特异性和灵敏度不足的瓶颈。

巢式PCR作为一种利用两套引物对进行两轮扩增的改良的聚合酶链式反应，其第一轮扩增采用的外引物对与普通PCR相似，第二轮扩增采用的内引物可结合在第一轮扩增DNA片段的内部并且第一轮扩增产物作为模板，因而降低了扩增多靶点的可能性，有效增加低丰度核酸样品的检测特异性和灵敏度。另一方面，由于巢式PCR包含两轮PCR扩增，相比于常规PCR其耗时量倍增，特别是在传统热循环仪上巢式PCR通常需要2.5~4 h才能完成，导致检测的时效性受到极大限制。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的不足，实现对低丰度核酸快速超灵敏检测与分析，本发明的目的在于提供一种连续流动巢式PCR微流控方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种连续流动巢式PCR微流控方法，包括如下步骤：

1）提取待测样本的基因组DNA；

2）引物设计：针对目标检测物的特异性基因DNA序列设计由一对外引物和一对内引物构成的巢式引物；

3）配制PCR反应体系：第一轮PCR反应体系含有外引物；第二轮PCR反应体系含有内引物；

4）第一轮PCR反应：将待测物的DNA样品加入第一轮PCR反应体系中，得到第一轮PCR反应液，将第一轮PCR反应液注入连续流动巢式PCR微流控装置中，完成20~35个PCR热循环；

5）第二轮PCR反应：取部分第一轮PCR扩增产物加入第二轮PCR反应体系中，充分混匀后，得到第二轮PCR反应液，将第二轮PCR反应液注入连续流动巢式PCR微流控装置中，完成20~35个PCR热循环。

优选的，第一轮PCR反应体系包括：

组分                           终浓度

 Taq 聚合酶                0.05~0.1U/μL

 Tris-HCl（pH=8.3）    10 mM

 KCl                           50 mM

 MgCl₂                              1.5 mM

 4×dNTP Mixture       0.2 mM

 外引物1                   200~300 nM

 外引物2                   200~300 nM

 第二轮PCR反应体系包括：