[发明专利]一种多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术基因表达分析领域，尤其涉及一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法。

背景技术

目前已发现有些基因的表达差异与疾病发生、药物反应相关，这些基因能够作为疾病的遗传标志。研究特定组织中基因的表达情况，发现新的疾病遗传标志基因，是现代医学研究的热点。

人类复杂性状疾病是当前研究的热点与难点。糖尿病、癌症、老年性性痴呆和精神分裂症等疾病的遗传机理和相关效应基因仍未最终揭晓。通过全基因组转录图谱来查找候选基因是复杂性疾病研究的重要步骤，也对进一步理解人类复杂性疾病和分子药物的研发提供了帮助。目前，已有研究将转录图谱用于癌症诊断和疗效比较、肿瘤分类，预测肿瘤对化学治疗药剂的疗效等临床分析中。

随着分子生物学技术的发展，基因表达谱分析手段也迅速发展起来。cDNA芯片能成功的从各种反应条件下筛选出差异表达的基因，且被作为候选基因进行假设验证和功能分析。芯片技术优势是一次分析几千至上万基因，可用于大规模的基因表达筛选，但同时存在定量准确度低的缺陷，极高的实验成本亦限制其广泛推广。基因表达分析中最常用的技术就是实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)，它具有Northern blot等技术所不具有的定量分析能力，可对芯片结果进行进一步确认。其具有稳定性好、灵敏度高和7个数量级的定量线性等优势，但同时它也存在单管检测通量小、样本处理费时费力成本高等缺点。虽然有研究表明哺乳动物细胞约含3万个基因，平均每个细胞约有1万个基因参加表达，但是通常的状况是，10到50个基因表达与一种特定的疾病相关，10到50个基因和一个特定的通路和药物反应相关。此外，考虑到多基因性状(Multigenic traits)受到基因-环境相互作用影响。因此一种可针对10种或数十种基因表达鉴定的分析方法亟待开发，可对不同环境下大量的样本进行多个基因分析。贝克曼GeXP多重基因表达分析系统作为芯片和PCR技术的换代产品，将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合，采用通用引物和特异引物相结合的方法，实现多重基因定量检测，其优势在于可在同一样本中对多个基因进行检测，大大提高了反应效率，节约临床资源和成本。但扩增过程中位点间扩增效率易相互影响，一个基因的表达会影响其他基因，而且这种终点法检测，不能完全反应初始模板的浓度。美国Sequenom公司基于竞争性PCR结合质谱分离技术进行mRNA定量分析。竞争性PCR最早是wang等人于1989年发明用于目标基因表达量的确定，其理论基础是人工合成一段内对照序列，其与目标基因序列相似，但存在长度上的差异，两者用共同引物进行扩增，具备类似的扩增效率，因此两种扩增产物量比值可以真实反映掺入内对照与目标基因mRNA量的比，这样根据内对照掺入量可以很好评估目标基因mRNA的量。这种竞争PCR技术运用到基因表达分析中降低了位点扩增效率差异以及实验操作和检测环境等外界环境的影响，从而降低实验结果误差，提高数据准确性。但质谱平台中产物质谱峰比较低，检测准确性需控制背景信号，且保证合适的样本与内对照用量比，同时整个过程中反应步骤比较多，显得较为繁琐。

发明内容

本发明的目标是要克服现有技术的缺陷，提供一种成本低、定量通量较高、样本需要量低、检测灵敏性高的多基因表达分析方法。该方法是基于竞争性PCR原理，结合荧光通用引物和多重嵌合特异引物使用，实现多重PCR扩增以及包括毛细管电泳在内的长度差异片段分离，对多个目标基因及一个或以上的参照基因进行同时定量，并以参照基因校正获取每个目标基因的相对表达量。

本发明的技术方案之一是提供一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法，包括以下步骤：

(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少一对参照引物组成：所述通用荧光引物长度范围为10～25bp，5’端用荧光标记，且对待测基因组无特异性匹配；所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为32～46bp，3’端为15～25bp的特异引物序列段，5’端为所述通用引物序列；所述参照引物针对待测基因组的非待测基因设计，且与待测基因无特异性匹配；所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；

(2)定量合成内对照DNA片段：针对待测基因和参照基因的扩增产物片段，合成相对应的内对照序列，并进行精确定量；所述内对照序列与所述待测基因和参照基因的扩增产物片段相比插入或缺失至少3bp的DNA片段；