[发明专利]一种多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法

权利要求书

1.一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR定量基因表达谱分析方法，包括以下步骤：

(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少一对参照引物组成：所述通用荧光引物长度范围为10～25bp，5’端用荧光标记，且对待测基因组无特异性匹配；所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为32～46bp，3’端为15～25bp的特异引物序列段，5’端为所述通用引物序列；所述参照引物针对待测基因组的非待测基因设计，且与待测基因无特异性匹配；所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；

(2)定量合成内对照DNA片段：针对待测基因和参照基因的扩增产物片段，合成相对应的内对照序列，并进行精确定量；所述内对照序列与所述待测基因和参照基因的扩增产物片段相比插入或缺失至少3bp的DNA片段；

(3)多重竞争性PCR的反应过程：

a)用oligo(dT)引物逆转录合成所述待测基因和参照基因的cDNA；

b)将所述cDNA与所述的定量内对照片段混合，加入所述的通用荧光引物、嵌合特异引物和参照引物进行多重竞争性荧光PCR扩增；使上下游的嵌合特异引物将通用引物序列加到各基因扩增片段两端；并使用高浓度的荧光通用引物完成PCR反应过程；

c)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测基因与参照基因和内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；

(4)数据分析：计算待测基因扩增产物(S)和内对照扩增产物(I)的荧光峰高或峰面积之比(S/I)；计算参照基因扩增产物(S)和内对照扩增产物(I)的荧光峰高或峰面积之比(S/I)；将待测基因的比值(S/I)除以参照基因的比值(S/I)即可获得样本目标基因的相对表达量。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述通用荧光引物长度范围为18～20bp。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为38～40bp。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，多重PCR引物对应的不同扩增产物片段的长度差异为8～50bp。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的3’端的特异引物序列段长度为18～20bp。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一到四对不同荧光标记的通用荧光引物、一到二十五对针对相同或不同待测基因的嵌合特异引物和一到三对针对相同或不同基因的参照引物组成。

7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一到五对针对不同待测基因的嵌合特异引物和一对参照引物组成。

8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的荧光通用引物的3’端为两个碱基的固定组合。

9.权利要求1所述的分析方法在找寻差异基因中的应用。

10.一种基于权利要求1所述的分析方法的试剂盒，提供通用荧光引物、嵌合特异引物、参照引物和定量的内对照DNA、和/或多重竞争性PCR的反应的试剂。