[发明专利]一种脂肪酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种脂肪酶及其编码基因与应用。

背景技术

饲料油脂来源问题已成为水产饲料配制的瓶颈问题。近年来，由于油脂价格不断攀升(鱼油从2005年8000元/吨上涨到2011年12000元/吨，豆油从2005年5000元/吨上涨到2011年10000元/吨，分别上涨50％与100％)，水产饲料企业不得不大量使用廉价油脂(如米糠、棕榈油、椰子油等)，但廉价油脂负面效应突出：油脂氧化、鱼体脂肪肝、代谢紊乱、鱼肉品质下降、水体环境污染等问题。从生物工程角度来解决这一水产实践问题(让廉价油脂高效化)变得紧迫且可行。

水产外源脂肪酶的添加可创造解决上述问题。脂肪酶是动物体内的一种重要消化酶，主要分解饲料中的甘油三脂、磷脂和甾类化合物。肠道是鱼类消化脂肪的主要部位，但是由于以下因素导致鱼类内源性脂肪酶效率的下降，也由此限制了其它廉价油脂添加：①水温，水产动物对脂肪的消化在水温18-25℃时最佳，而低于18℃或者高于25℃时，则消化率明显下降；②脂肪不饱和度，不饱和双键越多则越难以消化利用；③脂肪链长，无论是冷水鱼还是温水鱼添加饱和脂肪的效果均很差，在同样数目不饱和键的情况下，脂肪酸长度越长，消化率越往下降。

水产饲用脂肪酶已有报道，添加优势在于：①提高饲用油脂的利用率，改善饲料香味和风味，促进动物食欲，降低脂肪肝发病率；②节约蛋白质(3-5％水平)和多不饱和脂肪酸的添加水平，从而最大限度利用廉价油脂，间接降低氮、磷排泄量，减少环境污染；③酶解释放的中链脂肪酸能抑制肠道有害菌群，并对肠道局部炎症有一定疗效(类抗生素效应)。

现有商业化脂肪酶存在缺陷：①商品化的脂肪酶不适用于水产饲料用，在pH稳定性、最适pH、最适温度上存在不足。②表达量及比活低，大多介于100-2000U/μg酶活表达量，导致添加成本高，限制了工业化应用。

水产饲用脂肪酶市场前景广阔。2010年我国水产配合饲料产量达1500万吨规模，其中油脂消耗量(按平均2％添加)达30万吨/年，如能找到水产饲用脂肪酶的话按市场规模3000吨/年(按0.2kg酶制剂/吨添加)，按市场占有率20％，可节约油脂1.2万吨，节约饲料成本100元/吨，大幅提高养殖效益，因此具有重大意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白。

本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)或(c)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)序列表中序列2的自N末端第21-408位氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶功能的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。

上述编码基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中的序列1所示的DNA分子；

2)序列表中的序列1自5’末端第61-1224位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下可与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶功能所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码具有脂肪酶功能所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为在pET-28载体的EcoR I和Not I酶切位点间插入上述蛋白的编码基因得到的重组载体。

上述重组菌是将上述的重组载体导入到大肠杆菌BL21中得到的重组菌。

本发明的另一个目的是提供一种引物对。

本发明提供的引物对，由序列表中的序列3所示的引物1和序列表中的序列4所示的引物2组成。

上述引物对用于扩增上述编码基因的全长或其任一片段。

上述的蛋白作为脂肪酶的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述脂肪酶具有如下1)-6)中至少一种性质：

1)耐受有机溶剂，所述有机溶剂进一步具体为甲醇、乙醇、甘油或正庚烷；