[发明专利]一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种柑橘溃疡病菌侵染过程观察方法，尤其是涉及一种利用增强型绿色荧光蛋白基因egfp对柑橘溃疡病菌进行标记，实现对柑橘溃疡病菌侵染过程进行实时观察的方法。 

背景技术

对柑橘溃疡病菌入侵途径的传统研究手段，主要是扫描电镜和透射电镜两种观察方法，但是，这两种方式均费时、费力，且不能实时地进行跟踪。 

利用绿色荧光蛋白基因对病原菌进行标记，可以对病原菌进行快速、原位、实时、活体的观察，有利于观察病原菌的入侵过程和了解病原菌与寄主的互作。 

目前，国内外已有不少利用荧光标记这一手段对病原菌进行标记，从而观察植物病原菌与寄主互作的报道。 

但是，在柑橘溃疡病菌的研究中，由于多种原因，目前仅限于将绿色荧光蛋白基因作为报告基因与目的基因融合，以辅助研究目的基因。迄今为止，尚无利用绿色荧光蛋白标记对柑橘溃疡病菌侵染过程进行实时观察的报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术使用扫描电镜和透射电镜等费时费力的不足，提供一种操作简便快捷的柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法。 

本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是， 一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法，包括以下步骤： 

（1）利用三亲本杂交法将广泛寄主载体pMP2463上的egfp基因导入野生型柑橘溃疡病菌，使野生型溃疡病菌在不丧失其致病能力的情况下能产生绿色荧光蛋白，这种EGFP在紫外光激发下可经荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测到绿色荧光信号，从而获得EGFP标记的溃疡病菌；

（2）将步骤（1）所得EGFP标记的溃疡病菌通过喷雾方式接种到柑橘叶片表面及通过注射方式接种到柑橘叶肉间隙；

（3）于不同的时间点撕取叶表皮或者利用冷冻切片等快速制样方法制样，EGFP标记的溃疡病菌在激发光的激发下呈绿色，通过激光共聚焦显微镜观察柑橘溃疡病菌在叶片表面及叶肉间隙的数量和分布。

采用本发明，能够利用EGFP标记的柑橘溃疡病菌对该病原菌在侵染柑橘过程中的附着、繁殖和空间分布进行实时观察，从而获得柑橘溃疡病与柑橘互作的时空关系；不同柑橘品种对该病原菌的抗病性也能得到直观体现；操作简便、快捷。 

附图说明

图1 是野生型和EGFP标记的柑橘溃疡病菌菌株荧光显微镜观察到的形态及活体针刺接种后的症状图； 

图 2是EGFP标记的溃疡病菌侵染冰糖橙叶片的过程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。 

实施例

本实施例包括以下步骤： 

（1）利用三亲本杂交法将供体菌大肠杆菌DH5α所含广泛寄主载体pMP2463上的egfp基因导入野生型柑橘溃疡病菌，获得EGFP标记的溃疡病菌；经EGFP标记的柑橘溃疡病菌在紫外光激发下发出绿色荧光，经荧光显微镜检测到绿色荧光信号，被EGFP 标记的柑橘溃疡病菌，其生长动力学及致病力较野生型没有显著差异；

所述三亲本杂交法使用的供体菌大肠杆菌DH5α (含egfp质粒pMP2463，该质粒具有庆大霉素抗性)由华中农业大学微生物重点实验室提供；辅助菌大肠杆菌DH5α（含mob位点的质粒pRK2013，该质粒具有卡那霉素抗性）由意大利卡塔尼亚大学Vittoria Catara教授提供；受体菌黄单胞杆菌柑橘致病变种 Xac DL509（Xanthomonas axonopodis pv. citriXac DL509，具氨苄青霉素抗性)由本发明者分离得到，该菌株于2012年2月24日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： M 2012034。

（2）将步骤（1）所得EGFP标记的溃疡病菌通过喷雾方式接种到冰糖橙叶片表面及通过注射方式接种到冰糖橙叶肉间隙； 

（3）于不同的时间点撕取叶表皮或者利用冷冻切片等快速制样方法制样，EGFP标记的溃疡病菌在激发光的激发下呈绿色，通过激光共聚焦显微镜可观察溃疡病菌在冰糖橙叶表面及叶肉间隙的数量和分布情况。

荧光观察所用显微镜型号为Nikon SMZ1000。 

冰糖橙溃疡病菌在叶片表面及叶肉间隙的数量和分布情况观察所用激光共聚焦显微镜型号为Zeiss LSM 710。