[发明专利]利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种地沟油甄别方法。

背景技术

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，缩写为C.elegans)为线虫动物门泄管纲动物，作为一种典型模式生物在科研领域被广泛应用。秀丽隐杆线虫通体透明，易于观察形态和行为；生命周期短，培养方便且廉价，易于保存和便于试验操作，秀丽隐杆线虫的实验研究已形成一系列国际标准化与规范化操作。在食物不足如重要营养因子匮乏等不适宜环境条件时，秀丽隐杆线虫会停止正常的生长发育，进入休眠阶段(dauer stage)。进入休眠状态的幼虫与正常发育的秀丽隐杆线虫在行为、形态和生理上存在显著差异，表现为活动行为显著减缓或者静止，停止进食，体型改变为瘦长，体色增黑，表皮(cuticle)增厚，生殖细胞停止分裂等。这种低代谢、保能量的状态，使其能够在恶劣环境条件下的存活时间远远高于秀丽隐杆线虫的正常生命周期寿命(约20天)。

地沟油，泛指在社会生活中普遍存在的各类劣质油，如回收的食用油、反复使用的炸油，以及通过过滤、加热、沉淀、分离等方法对城市下水道里的垃圾加工而成的“食用油”。“地沟油”是一种质量极差、极不卫生的非食用油。一旦食用“地沟油”，它会破坏人们的白血球和消化道黏膜，引起食物中毒，甚至致癌的严重后果。地沟油回流到餐桌的现象在中国普遍存在并在近年被广泛关注，而鉴定地沟油成为难题。目前国内尚未有检测地沟油的统一标准。单凭人的感官，地沟油的色、香、味与普通食用油几乎没有分别。即便是能探明底细的仪器也常常难以辨别真假。见诸报道的地沟油检测方法都存在一定盲区，准确率也有待提高，尚不足以对地沟油进行充分有效的鉴定。常规的通过胆固醇检测鉴定地沟油的方法存在操作复杂，仪器依赖度大，造成鉴定成本高。

发明内容

本发明目的是为了解决现有地沟油鉴定方法存在灵敏度低、精确度差、操作复杂、成本高的问题，而提供一种利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法。

利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法，具体是按以下步骤完成：一、制备培养基：采用NaCl、琼脂粉、蛋白胨、0.8mol/L～1.2mol/L的CaCl₂水溶液、0.8mol/L～1.2mol/L的MgSO₄水溶液、磷酸盐缓冲液和蒸馏水混合均匀得到培养液，密封后置于高压蒸汽灭菌锅中，并在120℃下灭菌处理15min～25min，然后降温至50℃～60℃，并在无菌环境下加入待检测食用油，再转移至培养皿中，最后在温度为20℃的无菌环境下干燥8h～12h，即得到培养基；二、培养：向步骤一制备的培养基中均匀涂入浓度为1×10⁹个/mL～2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液，然后37℃培养8h～12h，再将接入秀丽隐杆线虫幼虫进行培养46h，在培养24h时秀丽隐杆线虫幼虫发育为秀丽隐杆线虫成虫并产卵；继续培养12h时产卵发育成第二代秀丽隐杆线虫幼虫；再继续培养10h，若第二代秀丽隐杆线虫幼虫进入休眠状态，则待检测食用油不是地沟油；若第二代秀丽隐杆线虫幼虫不进入休眠状态，与正常培养基生长的秀丽隐杆线虫子代无明显差别，则待检测食用油是地沟油；步骤一中所述的培养液中NaCl的浓度为2×10^-3g/mL～3×10^-3g/mL，琼脂粉的浓度为15×10^-3g/mL～20×10^-3g/mL，蛋白胨的浓度为2×10^-3g/mL～3×10^-3g/mL，CaCl₂的浓度为0.8×10^-6g/mL～1×10^-6g/mL，MgSO₄的浓度为0.8×10^-6g/mL～1×10^-6g/mL；步骤一中所述的培养液中加入的磷酸盐缓冲液占培养液总体积的20‰～25‰；步骤一中所述加入的待检测食用油与培养液的体积比为(1～10)∶1000；步骤二中所述浓度为1×10⁹个/mL～2×10⁹个/mL大肠杆菌OP50菌液的涂入量为2mL/cm²～3mL/cm²；步骤二中所述的秀丽隐杆线虫幼虫的接种量为5只/cm²～10只/cm²。