[发明专利]阿苯达唑–2–氨基砜残留检测单克隆抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域。具体涉及一种能识别阿苯达唑残留标示物阿苯达唑-2-氨基砜的单克隆抗体，同时还涉及一种能识别阿苯达唑残留标示物阿苯达唑-2-氨基砜的单克隆抗体的制备方法，还涉及一种能识别阿苯达唑残留标示物阿苯达唑-2-氨基砜的单克隆抗体的用途。

背景技术

阿苯达唑是兽医临床上广泛使用的苯并咪唑类驱虫药，具有广谱、高效、低毒的特点。在牛羊等反刍动物使用较多，对常见的线虫、吸虫和绦虫均有驱杀效力。阿苯达唑给药后通过肝脏或胃肠道粘膜细胞的首过效应迅速代谢为阿苯达唑亚砜和阿苯达唑砜，最终转化为阿苯达唑-2-氨基砜。阿苯达唑原形在血浆中很难检测到，但其代谢物广泛分布到体内组织与体液，以肝脏中最多，其次为肾脏。阿苯达唑及其代谢物在动物组织残留具有毒理学意义，实验研究证实阿苯达唑或其代谢物的蓄积具有致畸和胚胎毒性等毒理学危险；此外，阿苯达唑治疗人的寄生虫病时具有潜在发生不良反应的危险，长期用药更易发生迟发的严重不良反应，涉及血液系统、消化系统、皮肤病、神经系统等，尤其是迟发的以脑炎综合症为主的神经系统疾病，有潜在致死、致残的危险。阿苯达唑及其代谢物的残留对寄生虫耐药性产生也有促进作用。

各国已将阿苯达唑列为食品残留重点监控对象，规定了其最大残留限量(MRL)和残留标示物(MR)。中华人民共和国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》对阿苯达唑在动物组织中残留也制定了最高残留限量。目前有关阿苯达唑及其代谢物的残留检测方法主要包括生物学鉴定法、免疫学分析法和仪器分析法等，其中液相色谱法(HPLC)是可食性动物产品中阿苯达唑及其代谢物残留检测应用最广泛的方法。仪器分析方法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常高；而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器。因此需要建立一个从筛选到确证的检测体系，有关阿苯达唑的残留确证方法已经相对完善，但可用于大批量样品初筛的检测方法研究较少。微生物鉴定法和免疫分析法是残留检测筛选的常用方法。阿苯达唑等苯并咪唑类药物具有驱虫的活性，基于寄生虫体外培养技术发展起来的生物学鉴定法在阿苯达唑等药物的残留检测中已有使用，但是存在特异性差、灵敏度低和结果判定困难等固有缺陷。

酶联免疫分析法(ELISA)是将抗原抗体反应与现代测试手段结合的超微量分析法，集现代测试方法的高灵敏度和抗原-抗体反应的强特异性于一体。相对于仪器分析法，免疫学分析法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、检测费用低等优点，适用于大批量样品的初筛。但到目前为止，只有数篇直接或相关的文献报道了阿苯达唑的免疫学检测方法。Johnsson等(2002)将阿苯达唑与人血清蛋白结合制备完全抗原，免疫羊后得到对阿苯达唑等8种苯并咪唑类药物有交叉反应的多克隆抗体。Brandon等(1994)利用苯并咪唑类药物大多数都具有氨基甲酸甲酯支链的特点，以5(6)-羧戊基-硫-苯并咪唑氨基甲酸甲酯半抗原制备单克隆抗体，并建立了间接竞争ELISA方法，最低检测限可达10μg/kg。获得的抗体可以识别阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、芬苯达唑等含有氨基甲酸甲酯支链的苯并咪唑类药物。以上报道的ELISA方法都未能形成商品化的试剂盒，这是因为其制备的抗体存在缺陷，不能识别阿苯达唑--2-氨基砜。阿苯达唑--2-氨基砜是阿苯达唑残留标示物的重要组成部分，其在组织中的残留量与阿苯达唑的总残留量存在比例关系(约为20％)，美国甚至单独以它作为残留标示物检测阿苯达唑的残留。此外，Brandon等(1994；1998)认为将肝脏组织经简单的纯水或柠檬酸溶液(pH 3.0)一步提取后即可用于ELISA检测，但是从其报道的结果来看，回收率在14％～129％之间，普遍偏低于检测要求(60％～120％)。可见，研究一种基于阿苯达唑--2-氨基砜抗体的ELISA快速筛选方法对大批量样品中阿苯达唑残留检测具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不能识别阿苯达唑残留标示物阿苯达-2-氨基砜的缺陷，提供了一种能特异性识别阿苯达唑残留标示物阿苯达-2-氨基砜的单克隆抗体。该抗体除与阿苯达唑砜有68％的交叉反应外，与其他苯并咪唑类药物均无交叉反应。