[发明专利]内毒素检测及去除关键分子中国鲎C因子克隆和序列分析

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体是指中国鲎C因子基因的克隆和序列特异性位点分析。 

背景技术：

临床输液反应以热原反应危害最大，发生率最高。内毒素(即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS)是研究最透彻也是最常见的生物热原，同时更是各大药厂必须面对的难题，因为注射时即使是pg级别的痕量LPS，也会导致病人严重的热原反应。因此，灵敏可靠的内毒素诊断技术是非常必须的。 

海鲎的阿米巴样细胞(amoebocytes)对LPS具有超强敏感性，在革兰氏阴性细菌入侵时，它能通过一系列的酶促反应，对外来入侵的细菌产生级联凝集反应，使入侵的微生物失效(1，2)。这一过程(如图1所示)包括酶原状态的C因子(Factor C)识别并结合内毒素而被激活，变成活性酶的状态后，将下游的B因子激活，活化的B因子将凝固酶原转化为凝固酶，凝固酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，凝固蛋白相互交联脱水而形成凝胶(3，4)。 

利用海鲎血液阿米巴样细胞溶解物制成的鲎试剂，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素。自上世纪70年代中期，这一内毒素测试方法开始用于医药领域，并且很快被世界各国广泛采用，中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法。经过几十年的发展和改良，鲎试剂内毒素检测法已应用于制药、医疗器械、非内服制剂、医药制品、生物制剂、水质、食品检测以及科研等各大领域(5)。 

目前世界上仅有四种海鲎，即美国鲎(Limulus polyphemus)，中国鲎(Tachypleus tridentatus)，马来鲎(Tachypleus gigas)和圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)。而能够用于鲎试剂生产的仅有美国鲎和中国鲎两种，对应的鲎试剂分别称之为LAL(Limulus amoebocyte lysate)和TAL(Tachypleus Amebocyte Lysate)，二者反应原理及功效相同，但也存在理化特性的差别，如与内毒素反应的最适pH值等(6)。 

虽然鲎试剂检测法(LAL/TAL)具有高灵敏度(可检测飞克级内毒素)、快速等优点，但是由于采用成分复杂的细胞裂解物作为反应原料，同样具有无法克服的缺陷。比如，非特异性干扰问题：如图1所示，鲎试剂除了能与内毒素反应外，还会与(1-3)-β-D-葡聚糖反应(1)。(1-3)-β-D-葡聚糖是在真菌、酵母、蘑菇、高等植物中广泛存在的一种多糖，是构成细胞壁的结构大分子。因此鲎试剂检测过程中很容易遇到(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性干扰，造成假阳性结果，这对于成分复杂的药物，尤其是中药，是一个很大的检测挑战(7)。再比如，批次稳定性问题：鲎试剂采用海鲎血液作为生产原料，由于季节、地域等差异，使得鲎试剂的 批次差异成为常见现象。而且，由于环境污染、过度捕捞等原因海鲎的种群数量近年来急剧减少，接近灭绝(8)，使得生产鲎试剂的原材料面临日益匮乏的危险。 

鲎试剂的主要成分是一系列的丝氨酸蛋白酶原(9，10)，其中C因子在内毒素检测方法中是关键分子，在内毒素介导的鲎血凝集反应系统中，它特异性识别内毒素，并第一个被内毒素激活，从而启动整个鲎血细胞中的凝集级联反应(11，12)。因此，以鲎试剂的关键分子C因子作为基础，利用其识别并结合内毒素后，由蛋白酶原被激活为活性酶形式，从而能够水解发光底物的特点，结合化学/荧光发光定量技术，可以发展出以C因子作为单一成分的内毒素检测定量技术(13)，与传统的LAL测定技术比较，重组C因子在相同的分析条件下对内毒素具有更低的背景、更高的灵敏度(14)。 

基于C因子的内毒素检测技术成分单一，可以使用生物工程技术进行生产和严格的质量控制，从而避免了由原材料引起的批次不稳定性，同时保护了海鲎这一古老的“活化石”物种。尤为重要的是，这一新技术消除了传统鲎试剂对(1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性反应，可以大大增强内毒素检测的特异性，降低“假阳性”结果的发生概率。此外，通过与内毒素的特异结合，重组C因子还可以进一步应用于医药产品、生物制品等内毒素去除。综上，用分子生物学手段克隆C因子基因以应用于内毒素检测试剂的产品开发，具有重要的临床意义和巨大的商业价值。 

参考文献： 

1.Iwanaga，S.(1993)Curr Opin Immunol 5，74-82 

2.Muta，T.，and Iwanaga，S.(1996)Curr Opin Immunol 8，41-47