[发明专利]内毒素检测及去除关键分子中国鲎C因子克隆和序列分析

权利要求书

1.一种中国鲎C因子基因，其特征在于：由SEQ ID NO.1核酸碱基序列表所示，其中序列由3057bp组成。

2.一种按权利要求1中国鲎C因子基因，其特征在于：基因编码的蛋白具有SEQ IDNo.2中氨基酸序列。

3.一种按权利要求1所述的C因子基因的制备方法，其特征在于：

a)通过RNA抽提得到中国鲎C因子的血细胞总RNA：

将中国鲎从关节穿刺取血，同时加入10mmol/L咖啡因防止血凝集；在4℃，4000rpm离心10min收集血细胞；鲎血细胞总RNA的抽提如下进行：取细胞沉淀，加入1mlTrizol，室温放置5min，使细胞充分裂解；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置5min，使其自然分相；4℃，12000rpm离心15min，样品分三层，将上层水相(300μl)转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min；4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉淀于管底；往RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管；4℃，12000rpm离心5min，弃上清，短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置5min，晾干沉淀；加入适量(20μl)RNase Free水，充分溶解RNA；溶解的RNA取2μl稀释20倍后测浓度，用RNase Free水稀释至2μg/μl；

b)以a中的总RNA为模板，用合成的单链Oligo(dT)引物，通过逆转录反应扩增中国鲎血细胞的总cDNA；

c)以此鲎血细胞总cDNA为模板克隆中国鲎C因子全长基因。

4.按权利要求3所述的中国鲎C因子基因的克隆，其特征在于：

采用引物

F：5’-ATG GTC TTA GCG TCG TTT TT-3’

R：5’-AAT GAA CTG CCT AAT CCA TG-3’

以中国鲎血细胞总cDNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增得到具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

5.按权利要求4中所述的FC基因的制备方法，其特征在于聚合酶链式反应的PCR体系：

F：100pmol，R：100pmol，dNTP：各50pmol，5×Prime star DNA聚合酶buffer：10μl，Prime star DNA聚合酶：2-5U，无菌水补足50μl；

PCR反应条件：将上述PCR反应体系混匀，第一阶段95℃预变性3min；第二阶段95℃，1min；54℃，1min；72℃，3min20s；，共进行30个循环；第三阶段72℃延伸10min。