[发明专利]一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种羊痘病毒的PCR检测方法，特别涉及一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针荧光PCR检测方法，属于检验检疫技术领域。

背景技术

羊痘是绵羊痘和山羊痘的统称，是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)的绵羊痘病毒(sheeppox virus，SPPV)或山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病，主要表现为发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹，是所有动物痘病中最为严重的一种，有较高的死亡率，能造成巨大经济损失。羊痘在非洲中北部、亚洲中部和西南部以及印度大部分地区呈地方性流行。我国的贵州、广西、甘肃、黑龙江等地均有本病发生。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为法定通报传染病，我国将其列为一类动物疾病。有本病的国家和地区的易感动物及其相关产品被世界各国列为严格限制进出的对象，严重影响国际贸易和养羊业的发展。因此，快速、敏感和特异的诊断羊痘病毒的方法对于紧急控制和预防羊痘、减少经济损失具有重要的实际应用价值。

山羊痘病毒为双链DNA病毒，长度约150kb左右，其中碱基A、T均匀分布于整个基因组，含量约为75％，是A+T含量最高的痘病毒。目前已建立的检测羊痘病毒方法较多，如病毒培养、电镜观察、琼脂扩散、间接荧光抗体染色、血清中和试验、酶联免疫吸附试验检测技术等，但应用常规方法检测羊痘的存在费时、费力，特异性和敏感性不高等缺点。近年来，国内外也已有一些关于利用PCR方法从活体组织、组织培养物中检测羊痘病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针荧光PCR检测方法。本发明方法快速、准确、高通量、灵敏度高且特异性强。

本发明通过以下技术方案实现：

1.合成引物及TaqMan-MGB探针

选取羊痘病毒基因组末端反向重复序列(ITR)的保守区序列作为PCR扩增的靶序列，设计合成特异性的引物及探针，将该引物对扩增并BLAST，结果表明该引物及探针序列高度保守；该引物对及Taqman-MGB探针序列为：

ITRP1：5’-TTCACAGAAGAACAAGTTGGAGATG-3’，

ITRP2：5’-CATTAGGGAATCATGTGCAGTGAT-3’，

ITRProb e：5’-Fam-CCAATATTCTGCTGCTCTTGC-NFQ-MGB-3’。

或者是，上述引物序列的互补序列；再或者，是上述序列同源性大于75％的序列。

探针序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记末端连接MGB的非荧光淬灭基团。

2.构建阳性对照克隆质粒

用于构建ITR基因阳性对照质粒的引物如下：

上游引物：5’-ATTATAAAAAAGCCAATTAAACCTGT-3’

下游引物：5’-TGAAATCATACGTTGAGAGTGTAAGT-3’

以提取的山羊痘病毒ANHUI株基因组DNA为模板，使用上述引物按常规方法进行下列操作：扩增ITR基因片段，将回收目的片段与PCR2.1载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆后测序。测序结果与GenBank序列比对无误后，一20℃保存备用。

3.建立荧光PCR反应体系

依次加入以下反应试剂，建立50μL反应体系。

1)Quantitative PCR SuperMix-UDG with ROX 25μL

2)50mM MgCl₂           1.5μL

3)ITRP1                1.0μL

4)ITRP2                1.0μL

5)ITRProbe             1.0μL

6)模板5μL

7)ddH₂O                补足至50μL

反应参数为：50℃2min，95℃5min，95℃30s，60℃30s，45个循环。

本发明的另一个目的是提供一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测试剂盒，包括：

(1)荧光PCR反应混合液I

(2)荧光PCR混合液II

(3)阳性对照克隆质粒

(4)阴性对照

(5)使用说明书