[发明专利]一种提高酿酒酵母对乙醇、葡萄糖耐性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用转基因方法提高酿酒酵母对乙醇、葡萄糖耐性的方法。

背景技术

乙醇可直接作为液体燃料或者同汽油混合使用。作为可再生能源，可减少对不可再生能源石油的依赖，保障国家能源的安全。现行乙醇工业利用酿酒酵母无氧呼吸可产乙醇的特点，运用甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物，经过水解多糖转化为单糖葡萄糖(即糖化)后发酵转化为乙醇。

乙醇本是酿酒酵母发酵的重要产物，但累积到一定浓度会对酿酒酵母细胞产生毒害作用。尽管经过多年的努力，我国乙醇工厂的发酵醪乙醇含量已经增加到10％左右，但与国外发酵醪乙醇的浓度普遍在13％以上还有很大的差距。提高发酵浓度后可以大幅度地降低产品回收成本，例如乙醇蒸馏中乙醇浓度从7％蒸发到0.2％以下的能耗占总能耗的70％，提高发酵醪乙醇含量后该部分能耗的比例基本不变。换句话说就是在提高乙醇含量后可以由几乎相同的能量消耗蒸馏出更多的产品。另外，提高发酵醪乙醇浓度后，可以在基本不改动现有设备的情况下提高设备利用率，减少人工和能耗，减少工艺用水量，缩短发酵周期，减少发酵罐清洁费用，减少DDGS蒸发量，从而大幅度地降低生产成本。因此乙醇浓醪发酵一直是近年来研究的热门课题。

乙醇工业生产中，浓醪发酵对发酵性糖的转化率高，可提高产乙醇效率，降低生产成本。这就需要提高酿酒酵母对葡萄糖的渗透性。

综上所述，酿酒酵母选育种的目标就是提高酿酒酵母对高浓度葡萄糖、乙醇的耐受力。

发明内容

根据NCBI登录号为DQ985704的基因，将从第83至523个碱基的序列(命名为ApCL基因)，插入表达载体pGAPZαA后导入酿酒酵母，提高了酿酒酵母对乙醇、葡萄糖的耐性。

附图说明

图1是转ApCL基因、空载体和非转化酵母在16％乙醇胁迫下，在摇菌培养不同时间测定的OD600值

图2是转ApCL基因、空载体和非转化酵母在65％葡萄糖胁迫下，在摇菌培养不同时间测定的OD600值

具体实施方式

根据NCBI登录号为DQ985704的核苷酸序列，选取第83至523个碱基序列(命名为ApCL)，在其5′端加上EcoRI酶切位点序列GAATTC，3′加上XbaI酶切位点序列TCTAGA，委托上海生工合成，合成后连接在质粒pUC57上，即得到pUC57-ApCL质粒。用EcoR I和Xba I双酶切重组质粒pUC57-ApCL，酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收ApCL片段。双酶切表达载体pGAPZαA后，回收酶切产物大片段与ApCL连接，连接后转入大肠杆菌DH5α，Zeocin筛选出阳性克隆子，提取质粒后进行PCR、酶切、测序鉴定(质粒抽提、酶切、转化等步骤均按常规方法进行，DNA凝胶回收按照胶回收试剂盒说明书进行，测序由上海生工完成)。

提取重组质粒pGAPZαA-ApCL，用BlnI酶切成线性，并经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀。同时，制备酵母GS115感受态，取80μl感受态，加入10μl酶切产物，轻轻混匀后吸入电击杯冰浴5分钟后，电击转化(同时转化空质粒pGAPZαA作为阴性对照)。转化后立即加入1ml 1M山梨醇，28℃放置2小时后，均匀涂布在含有100μg/ml Zeocin的YPD平板上，28-30℃培养2-3天直至培养板上明显长出阳性单克隆菌落。

分别挑取培养板上长出的转化空质粒pGAPZαA和重组质粒pGAPZαA-ApCL的阳性克隆单菌落，以及未转化酵母，接种至5ml YPD液体培养基中(100μg/ml Zeocin)，28℃摇菌过夜(OD600值约2左右)。

各取1μl摇菌的菌液为模板，以质粒pGAPZαA的pGAP Forward priming site及3’AOX1priming site为两端引物，各自建立50μl反应体系，进行PCR鉴定。

待鉴定后，吸取1mL菌液分别接种至含16％乙醇或65％葡萄糖的50mL YPD液体培养基中，28℃250rpm摇菌，每隔12h吸取少量菌液测量其OD600值并记录。