[发明专利]百日咳杆菌69KD外膜蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白分离纯化领域，涉及一种膜蛋白的工业化大规模分离纯化，具体是百日咳杆菌的69KD外膜蛋白的工业化大规模分离纯化方法。

背景技术

百日咳是由百日咳杆菌引起的一种儿童急性呼吸道传染病，典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。最严重的并发症是继发感染，癫痫发作，脑病和死亡。

百日咳杆菌为革兰氏阴性球杆菌，长0.5～1.5μm，宽0.2～0.5μm，多单个分散，培养早期或者培养不适宜可呈链状或者多形态状。新分离的菌有荚膜，无芽孢，I相菌有菌毛。在包姜培养基表面上生长，菌落突起，边缘整齐，半透明，有光泽，色灰白，外观似珍珠状，菌落周围有明显的溶血环(医学生物制品学第二版赵凯章以浩李河民人民卫生出版社)。

百日咳杆菌主要感染对象多为6岁以下儿童，1岁以内婴幼儿发病率约占总发病率的50％，未获得免疫力的成年人也可被感染。百日咳在发病初期传染力最强，但不易诊断，所以不易控制传染源，切断传播途径，因此只有预防接种百日咳疫苗，减少易感人群，才能达到控制和消灭百日咳的目的。目前百日咳疫苗主要有WPV和APV，WPV是以百日咳鲍特氏全菌体灭活而成，在使用初期有效的控制了疾病的发展，我国从1978年开始实施WPV计划免疫，到1997年DTP(百白破联合疫苗)覆盖率达到96％，百日咳发病率已经由1978年开展计划免疫前的250.96/10万，下降到1999年的1/10万以下，下降了99.6％(中国免疫预防事业的成就与展望王克安中华流行病学杂志1990，20：325～327)。20世纪30年代Medson等制成WPV以来，经过不断的改进，至今世界各国已经使用近70年，预防效果是肯定的。但是疫苗接种后会产生一定的副反应，个别人还可能产生较严重的脑神经症状甚至死亡，受到人们的抵制，一些国家甚至停止使用，导致百日咳发病率有上升的趋势。因此需要研制新的有较小副反应的百日咳疫苗。

APV去除了大部分的有害物质，只含有一些有效的抗原成分，能够达到相似的免疫效果，但大大的降低了副反应的产生，使一些停止使用DTP的国家自大量使用DTaP之后，有效的降低了百日咳的发病率和死亡率。

日本是最先研制出APV的国家，以后美国、中国和其他国家也都有了APV产品，由于对有效保护抗原的认识不同，加上制备方法不同，因而APV中所含成分种类、含量及对其质量要求也有很大的差别。APV的生产方式有两种：共纯化生产方式和分别纯化并按一定比例混合的方式。共纯化生产方式是将百日咳杆菌的各种有效抗原一起纯化出来，并不能对各个组分精确定量。欧美国家已经普遍使用了分别纯化各组分，并按一定比例混合的方式。现阶段我国无细胞百日咳疫苗的生产采用硫酸铵沉淀加蔗糖密度梯度离心的共纯化方式。将培养物上清或者全培养物，以33重量％硫酸铵和50重量％硫酸铵分两段盐析或者两段33重量％硫酸铵盐析。将盐析沉淀物用0.5～1.0mol/L NaCl和缓冲液(pH8.0)抽提百日咳菌主要保护性抗原PT和FHA部分(可能含有少量PRN和Agg)。这种纯化方式简便快捷，但不能对无细胞百日咳疫苗的各组分抗原精确定量。为了进一步提高疫苗的质量，开发分别纯化各种抗原成分，然后按比例混合的百日咳组分疫苗将成为必然，因此摸索适合规模化生产各种有效抗原成分的制备方法是生产组份百日咳疫苗必不可少的步骤。

百日咳杆菌抗原物质主要有百日咳毒素(PT)，丝状血凝素(FHA)，69KDa外膜蛋白(PRN)，凝集原(Agg)，腺苷酸环化酶(AC)，脂多糖内毒素(LPS)，气管细胞毒素(TCT)和不耐热毒素(HLT)等，其中的PT，FHA，Agg，PRN可以作为组分百日咳疫苗的抗原成分。PRN是所有有毒力的百日咳杆菌产生的一种非纤毛性凝集原，存在于菌体外膜上，属于自主转运蛋白。它能产生保护水平的抗体，已经成为百日咳组分疫苗的重要抗原成分。本方法即为适合PRN的规模化生产的方法。

康诺特实验室有限公司的公开号为CN1193324的专利申请公开了用下述方法纯化69KD外膜蛋白：①发酵培养的菌液中加硫柳汞灭活细菌；②将灭活的细菌悬浮于含水介质如PBS中，加温45℃～60℃，接着冷却至室温或者4℃如此重复进行提取；③经沉淀作用和过Affi-gel Blue柱收集含PRN的溶液，用高浓度的盐，例如0.5mol/L氯化镁洗脱；④透析后，将其通过层析聚焦载体。此方法要经过两次层析柱，操作复杂，并且增加了成本，不太实用于大规模生产。