[发明专利]一种血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及一种血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段的制备，以及用该肽段制备的疫苗在治疗原发性高血压的应用。

背景技术

高血压是严重危害人类健康的世界性问题，中国高血压患病率18.8％(2002年)，目前全国有近2亿高血压患者。高血压是心脑血管病的主要危险因素，中国脑卒中发病率约250/10万人，冠心病发病率约50/10万人，积极控制高血压是预防脑卒中和冠心病的重要措施。目前中国门诊高血压患者治疗控制率30.6％，而中国高血压治疗总体控制率仅6.1％。高血压发病机制复杂，其中血管平滑肌细胞L型钙离子通道的激活在高血压的发病中有重要作用，钙通道激活后导致细胞内钙离子浓度升高，一方面使得平滑肌细胞收缩，尤其在小动脉和微动脉，使得血管阻力增加血压升高，此外，细胞内钙离子浓度升高亦可促进多种转录因子的表达，参与血管重构和血管炎症等病变。

导致血压升高各种因素均参与钙通道激活，导致血管收缩，因此，抑制血管平滑肌L型钙通道的钙通道阻滞剂是目前高血压治疗的有效药物，尤其是长效钙通道阻滞剂如硝苯地平控释片，氨氯地平等在高血压治疗中疗效确切且安全有效，被广泛使用。但是由于化学药物需要每日定时服药，患者治疗依从性不佳，导致高血压治疗控制率低，免疫学的发展为高血压治疗提供新的途径，迄今为止，用于高血压治疗的疫苗主要针对RAS系统，其中瑞士Cytos公司的CYT006-AngQβ疫苗已经完成了IIa期临床实验，有较好的降压效果。目前国际上尚未有使用主动或被动免疫方法阻滞钙离子通道，从而达到降低血压的相关报道。

发明内容

本发明旨在制备血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段，并将其与一种载体特别是病毒样颗粒耦联后制备成一种多肽-载体疫苗，将该疫苗用于治疗原发性高血压。此外，针对该肽段的抗体可以有效阻断L型钙离子通道。

该发明通过以下技术方案实现：

首先合成人血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段CGGPAEEDPS、CPAEEDPS、PAEEDPSGGC、PAEEDPSC，该免疫原性肽段包含第一连接位点，至少能够通过一个共价键与载体的第二连接位点结合。使用重组Qβ噬菌体颗粒蛋白、重组牛乳头瘤病毒蛋白、重组乙型肝炎病毒蛋白、匙孔血蓝素蛋白、破伤风类毒素作为载体，这些载体至少具有一个第二连接位点，优选的第二连接位点包括氨基、羧基和巯基，选自赖氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基和半胱氨酸残基，优选赖氨酸残基。使用异双功能交联剂将血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段与上述载体、优选地与重组Qβ噬菌体颗粒蛋白耦联结合，以形成有序、重复的多肽-载体疫苗。免疫原性肽段多肽被重复并以一定密度展示排列在载体上或者表面，形成高抗原性的阵列展示，利于高效的特异性的抗人和大鼠血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段抗体的生成，可以有效阻断L型钙通道介导的细胞内钙离子浓度升高以及后续级联升压效应，显著降低自发性高血压大鼠的血压，可用于原发性高血压的治疗。

本发明的优点是：

1、合成的肽段可以在自发性高血压大鼠体内引起特异性的免疫应答，产生针对肽段的特异性抗体。所产生的抗体能够与L型钙离子通道特异性结合，阻断通道开发引起的血管收缩及血压升高。

2、使用的异双功能交联剂具有能够同时连接两种基团的特点，而且不同的基团可以通过两步先后连接上去，这些基团是巯基、氨基、羧基和胍基，而这些异双功能交联剂是SMCC、Sulfo-SMCC、LC-SMCC等。

3、本发明制备的多肽-载体疫苗主要用于治疗原发性高血压，能够显著降低自发性高血压大鼠的血压，此外，针对多肽的抗体可以有效阻断L型钙离子通道。

附图说明

图1：QβCa-001疫苗制备后鉴定。图为：病毒样颗粒和短肽耦联后Tricine-SDS-PAGE电泳结果，M为Marker，泳道2为病毒样颗粒单体，泳道1为耦联短肽后病毒样颗粒

图2：免疫印迹法和细胞免疫荧光鉴定Anti-CN-8的特异性。Anti-CN-8为QβCa-001疫苗免疫动物后的抗肽抗体，Con为阴性对照抗体。图中A：免疫印迹法鉴定Anti-CN-8的特异性。图中B：细胞免疫荧光鉴定Anti-CN-8的特异性。

图3：用激光共聚焦显微镜观测Anti-CN-8抑制Bay K8644刺激引起的血管平滑肌细胞内钙离子浓度升高。F₀、F_max分别代表平衡后血管平滑肌细胞基础和最大荧光强度。