[发明专利]反向斑点杂交基因芯片及其制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学体外诊断技术领域，具体地讲是一种基因芯片，尤其是一种用于术后颅内感染快速诊断的反向斑点杂交基因芯片及其制造方法，在芯片上设置多种细菌的探针，其中包括开颅手术后患者脑脊液中一些常见病原菌，利用PCR扩增产物进行杂交试验检测、鉴定测试样本。

背景技术

目前临床实验室采用的传统细菌培养鉴定主要依靠表型鉴定，敏感性低，检测周期长，且受抗生素应用、病原菌自身生理条件等各方面的限制，不能满足临床快速诊断的要求。而且，这种方法的准确性也有一定差异。如常引起院内感染爆发流行的鲍曼不动杆菌，从表型上与醋酸钙不动杆菌、未正式命名的菌种3，13TU难以区分，依赖目前现有的商品化表型鉴定系统均难以区分。临床病例还存在合并多种细菌感染的可能，这也对传统细菌培养鉴定方法提出了挑战。

细菌核糖体RNA(rRNA)是细菌生命的标志，其16s rRNA和23s rRNA基因是以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因中。目前对细菌16s rRNA和23s rRNA基因间区的研究较多，特别是将其应用于细菌的检测。国外20世纪90年代初即有关于利用细菌16s rRNA基因结构特点构建基因芯片，并将其应用于细菌鉴定的报道。该技术以其高通量、快速、准确性高等优点为解决上述问题提供了一条新的途径，对流行病学和临床状况的认知有提高作用。

近年来，国内有人致力于寡核苷酸芯片技术用于临床细菌检测的研究，该种芯片以硝酸纤维膜和尼龙膜等不同载体和地高辛、胶体金显色等方法制备。毕春霞等开展了16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测脑脊液病原菌研究，但存在临床常见脑脊液致病菌覆盖不全、杂交时间长等不足，特别是缺少大样本临床验证数据。这可能大大限制了其临床应用价值。

目前市场上最主要的基因芯片产品是以点样等方法制备的用于基因表达检测的中、低密度基因芯片。基因芯片的一个重要发展趋势是芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析的标准化，提高基因芯片的准确性和可靠性。基因芯片技术，无论其反应条件、检测项目、数据分析较单一项目的分析都更为复杂化，而临床检验要求检测结果更为精确，因此，如何即保证检测高通量，又保证性能优越，是芯片技术的瓶颈问题之一。

发明内容

考虑到至少一个上述问题而完成了本发明。具体地，本发明的目的是提供一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的基因芯片及其制造方法。本发明包括了用于病原体基因检测进行鉴定种、属特异性探针和革兰氏阴性细菌通用探针、革兰氏阳性细菌通用探针，具有快速、灵敏的特点，是现有细菌鉴定技术的巨大突破。

具体地，一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的基因芯片，其特征在于包括在基质上设置的革兰氏阳性细菌通用探针、革兰氏阴性细菌通用探针、以及鉴定细菌的种、属特异性的探针，其中革兰氏阳性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGGTGCATGGTTGTCGTCA，革兰氏阴性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGCTGCATGGCTGTCGTCA；所述鉴定细菌的种、属特异性的探针至少一个选自：

本发明针对每种所鉴定细菌种/属的探针有着合理的碱基成分，探针的退火温度在42-43℃之间，相对比较均一，即10种探针和对应的PCR产物杂交时最适宜的温度条件基本一致，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。

根据本发明另一方面，该基因芯片还包括标记有生物素点的DNA序列(Bio)ATGTCGCATCTGCGTTGGAATC。

根据本发明另一方面，提供了一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的试剂盒，其特征在于包括前述的基因芯片以及各种引物，所述各种引物用于扩增临床样本中的DNA序列，包括：

扩增革兰氏阴性菌的上游引物    ACTCCTACGGGAGGCAGCA

扩增革兰氏阴性菌的下游引物    ATTACCGCGGCTGCTGGC

扩增革兰氏阳性菌的上游引物    TGCCTTTGTAGAATGAACC

扩增革兰氏阳性菌的下游引物    CTAAAGCTATTTCGGAGAGA。

根据本发明另一方面，提供了一种前述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

DNA探针的制备：合成与待测菌种DNA互补的5’末端经过胺基化的DNA片段，从细菌16S或23S核糖体RNA基因区中挑选出特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成出5’末端经过胺基化的DNA片段；