[发明专利]反向斑点杂交基因芯片及其制造方法

权利要求书

1.一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的基因芯片，其特征在于包括在基质上设置的革兰氏阳性细菌通用探针、革兰氏阴性细菌通用探针、以及鉴定细菌的种、属特异性的探针，其中革兰氏阳性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGGTGCATGGTTGTCGTCA，革兰氏阴性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGCTGCATGGCTGTCGTCA；所述鉴定细菌的种、属特异性的探针至少一个选自：

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于还包括标记有生物素点的DNA序列(Bio)ATGTCGCATCTGCGTTGGAATC。

3.一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的试剂盒，其特征在于包括权利要求1或2所述的基因芯片、以及各种引物，其中所述各种引物用于扩增临床样本中的DNA序列，包括：

扩增革兰氏阴性菌的上游引物        ACTCCTACGGGAGGCAGCA

扩增革兰氏阴性菌的下游引物        ATTACCGCGGCTGCTGGC

扩增革兰氏阳性菌的上游引物        TGCCTTTGTAGAATGAACC

扩增革兰氏阳性菌的下游引物        CTAAAGCTATTTCGGAGAGA。

4.一种权利要求1或2所述的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

DNA探针的制备：合成与待测菌种DNA互补的5’末端经过胺基化的DNA片段，从细菌16S或23S核糖体RNA基因区中挑选出特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成出5’末端经过胺基化的DNA片段；

固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上，先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的胺基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固的将探针固定在膜上；

制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。

5.一种权利要求3所述的试剂盒的制备方法，用于鉴定开颅手术后患者脑脊液中病原菌，包括以下步骤：

设计病原体特异性探针：选择细菌的16S和23S核糖体RNA基因为靶序列，从中选取种、属特异性和通用序列探针，序列号为SEQ ID No.1-10；

标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No.11；

各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，其序列分别为SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15；

探针处理：在5’末端经过胺基化处理，使其能够固化在尼龙膜上；

固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上；

基因芯片的制备：使用点样仪在尼龙膜上按预先设定好的顺序进行点样。

6.一种权利要求3所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

利用试剂盒中含有特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA；

对扩增后的DNA进行杂交；

检测基因芯片上结合的DNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

第一步：扩增样品

将临床样本中提取的DNA通过PCR反应进行扩增，所用引物的5’端标记有生物素，扩增得到5’端带有生物素标记的DNA产物；

第二步：杂交

将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的DNA探针、Bio进行反应

第三步：显色

在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIT系统显色，肉眼直接观察结果。