[发明专利]EPSP合酶基因水稻叶绿体表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种叶绿体表达载体，尤其涉及一种EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因水稻叶绿体表达载体及其构建方法，本发明进一步涉及该EPSP合酶基因水稻叶绿体表达载体在提高水稻草甘膦抗性中的应用，属于转基因水稻领域。

背景技术

1988年，Boynton等首次利用基因枪法将带有atpB野生型基因的叶绿体DNA轰击了atpB突变的衣藻，使其恢复了光合作用的能力，从而标志着叶绿体基因工程的开始。1900年，首次利用基因枪法将rrn16基因在烟草叶绿体中得到表达，拉开了高等植物叶绿体转化的帷幕。水稻、玉米及小麦等禾本科植物是重要的粮食作物，但是叶绿体转化技术在禾本科植物的应用进展却很缓慢。2006年，Lee等(Lee，S.M.，et al.，Plastid transformation in the monocotyledonous cereal crop，rice(Oryza sativa)and transmission of transgenes to theirprogeny.Mol Cells，2006.21(3)：p.401-10.)首次将CFP和aadA基因成功重组到水稻(Oryza sativa)叶绿体基因组中，为叶绿体转化技术在禾本科植物中的应用奠定了基础。李轶女等(李轶女等.水稻叶绿体表达体系的建立及抗PPT叶绿体转化植株的获得.中国农业科学，2007.40(9)：1849-1855.)选择ndhF与trnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点，将bar基因重组到水稻叶绿体基因中，bar基因在水稻基因组中正常的表达，既提高了水稻抗PPT的能力，又可以作为转化的筛选标记。Cui等(Cui，C.，et al.，Stable chloroplast transformation of immature scutella and inflorescences in wheat(Triticum aestivum L.).Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai).43(4)：p.284-91.)利用基因枪法将GFP和npt II基因转化小麦未成熟盾片和花序，培养获得了转化植株，为叶绿体转化技术成功的应用到禾本科植物培育新的品种奠定了基础。

叶绿体转化的表达效率高且外源基因可以定点整合，显花植物每个叶肉细胞含有约100个叶绿体，每个叶绿体含有约100个叶绿体基因组拷贝，如果完全同质化并有强启动子存在，外源基因可以得到高效的表达，同时叶绿体对外源基因的表达有很强的承受能力。叶绿体可以直接表达来自原核的基因；叶绿体基因组具有原核性，叶绿体基因组多顺反子转录、基因排列、调控方式、密码子的偏爱性等与原核性很相似。叶绿体的原核性利于原核来源基因的表达。但是真核基因在叶绿体基因中也能很好的表达。多基因可以同时在叶绿体转化，提高转化效率；叶绿体基因组具有重叠基因，是以多顺反子为转录单位，产生多顺反子mRNA来合成蛋白质，所以由一个启动子引导下的多个外源基因可以同时在叶绿体中表达，可实现多个基因的同时表达，多个外源基因可以同时进行表达，而不相互影响，避免因多个相同的启动子调控多个基因在表达时产生基因沉默现象。叶绿体转化没有载体序列、位置效应和多效应；属于母性遗传，后代材料稳定；安全性高。叶绿体是母系遗传，外源基因不会随花粉传播，造成基因漂移。

草甘膦是一种高效、广谱、低残留、低毒、易被微生物分解和内吸传导的非选择性的除草剂，被广泛的应用于农业，对大多数植物具有灭生性。由于草甘膦使用容易、高效、价格便宜，各国不断增加草甘膦的生产量以满足日益增加的需求。转基因的抗草甘膦作物大面积推广给农民提供了草甘膦使用的新领域。1996年孟山都公司开发的抗草甘膦大豆GTS40-3-2首次销售，到目前为止已经有超过1000个商业化的抗草甘膦大豆品种。

抗草甘膦的大豆、棉花、水稻、花生、烟草、甜菜等作物得到了推广。2003年全世界抗草甘膦大豆种植面积大于0.41亿hm²，其它抗除草剂的作物也大量的推广，主要是抗草甘膦品种。从已经推广的抗草甘膦作物来看，主要是美国的孟山都公司开发，转入的基因是CP4EPSPS基因。孟山都将抗草甘膦作物种子与农达除草剂捆绑式销售，已经形成了独霸的局面。虽然从微生物、植物等克隆出了一些抗除草剂的EPSPS基因，也获得了相应的转基因植物，但是很少能达到推广的水平。迄今为止，国内还没有出现广泛推广的抗草甘膦的新品种。