[发明专利]一种制备带有突出末端的双链DNA分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域一种DNA分子的构建方法。具体地，本发明涉及一种制备带有突出末端的双链DNA分子的方法。

背景技术

DNA(Deoxyribonucleic acid)，又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，是生命体内重要的遗传物质。自然界中的DNA主要由四种不同的脱氧核糖核苷酸(deoxytibonucleotide)按照不同的顺序排列而成，这四种带有不同碱基的核苷酸即腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，分别用字母A、G、C和T表示。这四种核苷酸通过核苷酸五碳环上5’位的磷酸基团与3’位的羟基之间形成的磷酸二脂键相连，这四种核苷酸的不同排列顺序构成了生物体遗传多样性的物质基础。

自然界中，生物体内的DNA以反向互补双链的形式存在，两条带有互补碱基的DNA链分子利用互补碱基之间的氢键结合在一起，形成一种特有的、稳定的双螺旋结构。不同的生物体内，DNA存在的形式多种多样，在同一个生物体的不同生长阶段，DNA的形式也可能不同。比如真核生物细胞核内DNA以高度结构化的染色体的形式存在，原核生物体内多以环状DNA的形式存在，质粒DNA以超螺旋的结构存在，有的病毒DNA以线性的形式存在。

在体外对DNA的操作，比如对DNA分子的扩增、切割、修饰与重新组装等，也成为重组DNA技术，是现代分子生物学发展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技术。广义来说，DNA的重组技术是指利用供体生物的遗传物质，或人工合成的DNA分子，经过体外的分离纯化、PCR扩增、限制酶切割等处理后与适当的载体连接起来形成新的重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入受体生物中，从而实现对目标DNA分子的保存、扩增和分析等操作。

体外对DNA的操作在各种工具酶(如限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等)的作用下，DNA分子的存在形式可以更加多样化。以线性DNA分子的末端为例，DNA链露出末端核苷酸5’磷酸基团的一端称为5’端，露出末端核苷酸3’羟基基团的一端称为3’端，反向互补双链DNA的末端则一条链是5’端，另一条链为3’端。如果一条DNA末端的5’核苷酸和3’核苷酸齐平，则该末端称为平末端(blunt end)；如果不齐平，即一条链在末端位置有一个或多个碱基冗余未能与互补链匹配，则该末端称为粘性末端(s“cky end)。粘性末端根据突出的链又分为5’突出末端和3’突出末端，分别对应5’突出链长和3’突出链长的情况。

在基因工程操作中，具有互补序列的DNA末端可以连接在一起，这对于DNA片段的切割和连接非常重要。产生DNA末端的方式也很多，比如利用DNA聚合酶通过PCR扩增获得的片段可以是平末端或3’有一个A碱基突出的粘性末端；利用不同种类的限制性内切酶可以获得平末端或带有1-5个碱基的5’突出或3’突出粘性末端；一些核酸外切酶或聚合酶也可以将突出末端变为平末端。

目前限制性内切酶是用来产生粘性末端最常用的工具，限制性内切酶种类很多，特异性强，可以根据需要设计带有限制性内切酶识别位点的DNA分子，通过酶的作用形成相应的末端。但是，目前所发现的内切酶中，最多只能产生带有5个碱基突出的粘性末端，而在有些实验中，比如单分子力学实验(single molecule experiment)或者特殊的DNA重组实验中，我们需要一些末端(5’或3’)突出长度达到10个或者更多碱基的DNA分子，面对这样的情况，限制性内切酶就无能为力了。

如果所需要的DNA分子较短，可以采用合成两条不对称的互补链的方式，一条链较长，另外一条链较短，将需要在末端突出的部分留出来，这样，两条单链DNA分子通过退火以后可以形成一端或两端，5’或3’有多个碱基突出的分子。但是，这种方法的问题也很多，首先，它只能针对较短的分子，由于DNA化学合成技术的限制，超过200个碱基的单链DNA分子很难通过化学合成的方法直接获得，因此也难以产生超过200个碱基对的双链DNA分子；其次，随着DNA长度的增加，DNA化学合成过程中的错误率越来越高，而且，最重要的是，这个错误在形成DNA双链后很难被检测或修复；再次，由于引物较短，DNA双链退火过程中可能产生错配的分子；最后，目标分子的纯化存在困难而且这种方法很难被扩大获得大量的目标分子。