[发明专利]一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于功能食品领域，具体涉及一种从长蛇鲻鱼肉蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽(ACEI)及其制备方法。

背景技术

高血压是最常见的心血管疾病之一，是导致中风、心力衰竭和心肌梗塞等疾病的重要因素。在高血压人群中，95％以上的患者是原发性高血压。

目前合成的血管紧张素转换酶抑制剂虽能有效地降低高血压，但临床有许多不良反应。天然ACEI多来源于动植物、微生物蛋白和蛇毒，通过对天然ACEI的研究，特别是对其结构和功能的揭示，可为合成药用的ACEI奠定基础并促进其发展。至今为止，人们已经利用多种蛋白酶水解各种食物蛋白、植物中得到了超过200多种的ACEI。海洋生物蛋白的主要氨基酸组成及序列与陆生蛋白有明显的不同，同时海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远大于陆地蛋白资源。《水产科学》2006年第3期第158-160页报道了利用水产蛋白酶解制备降血压肽，从鱼肉蛋白、虾等海产品中制备所得的降血压肽的活性优于其他食源性蛋白，现已从磷虾、金枪鱼、沙丁鱼、鲣鱼等海洋生物中发现了多个降血压肽。中国专利(ZL 200410075836.4)公开了中国毛虾蛋白降血压肽及其制备方法与应用，从中国毛虾中分离出由6个氨基酸组成的ACE抑制短肽，其活性良好。

长蛇鲻(Saurida elongata)，为狗母鱼科长蛇鲻属，地方名有香梭、神仙梭、沙梭、狗棍、丁鱼等。主要分布于西北太平洋、中国南方沿海海域，为我国主要经济鱼类之一，年产量较大。长蛇鲻由于经济价值低，加之技术工艺不健全，长期以来一直作为饲料鱼粉原料，目前还没有关于使用长蛇鲻鱼肉蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的报道。

发明内容

本发明提供一种来源于海洋鱼类长蛇鲻鱼肉蛋白血管紧张素转换酶抑制肽及其制备方法，其特征在于以长蛇鲻鱼肉蛋白为原料，采用枯草芽孢杆菌1398所产生的中性蛋白酶水解，经超滤、凝胶分离、反相高效液相分离得到。

本发明具体实现步骤及条件如下：

(1)往长蛇鲻鱼肉蛋白粉加水制成蛋白含量为2～5％的反应原料液；然后往反应原料液中，加入0.5～5％中性蛋白酶，在35～55℃及pH为6.0～7.5下水解2小时，最后加热至100℃灭酶5～20min得到酶解液；

(2)用分子量为5000Da的超滤膜将酶解液超滤，对超滤透过液以水为流动相通过Sephedex G-15凝胶层析柱进行分离，层析柱流出液用蛋白核酸检测仪在220nm处进行进行检测，根据检测谱图(见图1)收集3号吸收峰的流出液得到纯化液；

(3)以C18为色谱柱、水和乙腈为流动相以及220nm检测波长二极管阵列检测器监测，采用高效反相液相色谱对纯化液进行二次分离，其中第一次分离以水和乙腈比例为95∶5-50∶50为流动相，流速0.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图2)收集7号吸收峰的流出液；第二次对7号吸收峰流出液进行洗脱梯度分离，第一阶段的流动相水和乙腈比例为95∶5-80∶20，维持时间为8min，第二阶段的流动相水和乙腈比例为80∶20-70∶30，维持时间为16min，二阶段流动相的流速均0.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图3)收集2号吸收峰的流出液；最后对2号吸收峰流出液冷冻干燥即得血管紧张素转化酶抑制肽。

本发明得到的抑制肽，经串联飞行时间质谱测定，其氨基酸序列为Ser-Pro-His-Tyr-Arg(丝氨酸-脯氨酸-组氨酸-酪氨酸-精氨酸)，经马尿酰组氨酰亮氨酸法液相色谱测定，它抑制50％ACE活性所需抑制剂的浓度(IC₅₀)不超过48.2μM。

测定该血管紧张素转化酶抑制肽的半数抑制浓度(IC₅₀，抑制50％ACE活性所需抑制剂的浓度)，取适量血管紧张素转化酶抑制肽用pH值8.3硼酸缓冲液配制成一定量浓度的溶液，血管紧张素转化酶(ACE)、底物马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)同样用此缓冲液溶解。测试的总反应体积保持在0.20mL，取适量的血管紧张素转化酶抑制肽，加入适量的硼酸缓冲液和30μL ACE，在37℃恒温水浴保温10min，随后加入50μL 5mmol HHL开始反应。60min后，加入0.15mL1mol/L HCl中止反应，离心15min后，取上清液用HPLC分析马尿酸的含量并计算被测物对ACE的活性。

本发明制备抑制肽的原料来源广泛、廉价，资源丰富，制备方法简单、成本低且容易操作，具有较强的适用性。

具体实施方式