[发明专利]一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法和该抑制剂在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

GRP78(glucose-regulated protein，GRP78)在正常细胞中与ATF-6、IRE1(inosito lr equiring enzyme 1)和PERK(double st randed RNA activated protein kinase like ER kinase)结合形成无活性状态复合体。当非折叠蛋白增多，GRP78即与该复合体分离激活，将信号传递到细胞核中从而启动非折叠蛋白反应促进蛋白质的正确折叠，防止非折叠蛋白的累积，靶向降解错误折叠蛋白。有研究表明，GRP78在肿瘤细胞中通常发生过表达，并且可以特异的存在于肿瘤细胞的表面，而正常细胞膜表面不含GRP78。因此，肿瘤细胞表面的GRP78可以作为抗肿瘤的特异性的分子靶点。有研究通过噬菌体展示技术发现，多肽片段可以与肿瘤细胞表面的GRP78特异结合并通过GRP78进入细胞内部，可以作为抗肿瘤靶向药物的导肽。

人类蛋白酶体CP的沉降系数为20S，分子量约700～750kD。它由α环和β环组成，每个环各有7个相同的亚单位，不同的β亚单位的催化活性尽管不同，但能互相协调使蛋白酶体具有多种蛋白酶活性，如类糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like，ChTL)、类胰蛋白酶活性(trypsin-like，TL)、肽-谷氨酰肽水解酶活性(post-glutamyl-peptide hydrolyzing，PGPH)、支链氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。由于蛋白酶体活性状态对细胞执行不同的功能是非常重要的，因此蛋白酶体将成为影响细胞功能的重要药物靶标，而其抑制剂有可能成为抗肿瘤的先导药物。泛素-蛋白酶体系统是细胞内调节蛋白平衡的蛋白降解系统，在细胞的生命活动中发挥了关键作用。蛋白酶体含有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和肽-谷氨酰肽水解酶活性，其活性的抑制可以诱导细胞凋亡。硼替佐米(Bortezomib)是第一种用作化学治疗药物的蛋白酶体抑制剂，由千年制药公司(Millennium Pharmaceuticals)开发，市场名称为Velcade。硼替佐米主要被用于多发性骨髓瘤的治疗。值得一提的是，多发性骨髓瘤会导致血清中蛋白酶体水平的提高，而成功的化疗可以将蛋白酶体的水平恢复到正常范围。硼替佐米在治疗B细胞相关癌症的临床前和早期临床研究已经开始，但是，Bortezomib在肿瘤的治疗中表现出了许多副作用，对癌细胞的杀伤专一性不够强，因此，研发对癌细胞具特异杀伤的药物迫在眉睫，对肿瘤的预防具有重要的和深远的意义。

有文献报道，已经发现一肽段可与肿瘤细胞表面的GRP78特异结合，其序列为：WIFPWIQL。本实验室通过基因工程手段将绿豆胰蛋白酶抑制剂赖氨酸活性区域与该GRP78结合肽段(glucose-regulated protein binding peptide)，通过设计一个相同的限制性内切酶位点，构建成融合蛋白，制备能够通过与肿瘤细胞表面GRP78结合，且靶向抑制肿瘤细胞蛋白酶体的靶向抗癌药物(GBP-K33)。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法和该抑制剂在制备抗癌药物中的应用。

本发明提供的一种胰蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，该抑制剂对癌细胞增殖有抑制作用，对癌细胞的凋亡有促进作用，对正常细胞却没有任何毒副作用。

编码所述胰蛋白酶抑制剂的基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：2。该核苷酸序列由123个核苷酸组成。

一种载体，含有上述所述的核苷酸序列。它是将编码GBP-K33的核苷酸片段克隆至原核表达载体后获得的重组子pGEX-4T-1-GBP-K33。所述的载体，是一种质粒。

一种工程菌，含有上述所述的载体。是将重组子pGEX-4T-1-GBP-K33转化至一种菌中，例如大肠杆菌BL21中，构建成工程菌。

胰蛋白酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤：化学合成基因GBP片段和K33，将这两段序列连接到pGEX-4T-1载体上，获得重组子pGEX-4T-1-GBP-K33，将该重组子转化到大肠杆菌BL21，构建大肠杆菌工程菌pGEX-4T-1-GBP-K33/BL21，将该工程菌接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至A 600nm为0.4-0.6，加入IPTG使终浓度为0.5mmol/L，诱导表达3-5小时，收集菌体，将上清液经亲和层析纯化获得目的蛋白。