[发明专利]一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内生细菌及其分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种内生细菌，尤其涉及一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内生细菌，同时还涉及一种该内生细菌的分离方法。 

背景技术

番茄早疫病是由半知菌亚门茄链格孢菌(Alternaria solani)引起，在全国各地都有发生，是番茄的主要病害之一。目前对于该病的防治主要依靠化学药剂，然而随着对环境保护意识的增强，人们越来越重视化学农药所造成残留和环境污染问题。生物防治已经成为控制病害的重要手段，而植物内生细菌作为植物病害生物防治的潜在资源菌具有独特的优势，并且已经显示出很好的利用前景。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内生细菌。 

同时，本发明的目的还在于提供一种该内生细菌的分离方法。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种能够促进番茄生长并拮抗三种病害的内生细菌，命名为Fb9(Bacillum sp.)，保藏于位于中国，武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年12月8日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2011448。 

本发明的技术方案采用了一种内生细菌的分离方法，包括以下步骤：采集健康番茄植株的根、茎、叶各3g，在75％的酒精中浸泡30s，然后用0.1％的升汞消毒3min，用无菌水冲洗5次后，于灭菌的研钵中研磨，加入5ml无菌水混匀，分别取最后一次的冲洗液和研磨液200ul，涂布于NB培养基平板上，在28℃下培养，逐日观察，如最后一次冲洗液涂布的培养基中无菌落，在研磨液涂布的培养基中长出的菌落为内生细菌，进行纯化培养后，4℃冰箱中保存备用。 

所述的冲洗液组成为：75％的酒精中浸泡30s，1％的升汞消毒3min，无菌水冲洗5次，无菌水是经过高压蒸汽灭菌锅灭菌的蒸馏水。 

所述的研磨液为无菌水，无菌水是经过高压蒸汽灭菌锅灭菌的蒸馏水。 

所述的NB培养基组成为牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂条18g，加蒸馏水至1000mL。 

本发明利用稀释分离法，从健康的番茄植株中分离得到11个细菌菌株。通过平板对峙试验筛选出对三种病菌抑菌效果最好的Fb9菌株，对番茄早疫病菌、番茄菌核病菌、黄瓜枯萎病菌抑菌率分别为70.81％、74.35％、65.17％。Fb9菌株对番茄的生长具有促进作用，对番茄早疫病的室内盆栽防治效果为63.7％。经试验：通过分离筛选获得对番茄早疫病具有防治效果的番茄内生细菌菌株，并鉴定出该菌株对番茄的生长具有促进作用。 

本发明的内生细菌，命名为Fb9（Bacillum sp.)，保藏于位于中国，武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年12月8日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2011448。

具体实施方式

本发明的内生细菌的具体分离过程如下： 

1.材料与方法 

1.1供试菌株与番茄品种 

番茄早疫病菌Alternaria solani和黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum从田间发病植株上分离得到，番茄菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum由河南科技大学林学院植保系实验室保存；供试番茄品种为‘中蔬四号’。 

1.2培养基 

细菌培养用NB培养基，真菌培养及平板对峙试验用PDA培养基。 

1.3番茄内生细菌的分离 

采集健康番茄植株的根、茎、叶各3g，在75％的酒精中浸泡30s，然后用1％的升汞消毒3min，用无菌水冲洗5次后，于灭菌的研钵中研磨，加入5ml无菌水混匀，分别取最后一次的冲洗液和研磨液200ul，涂布于NB培养基平板上，在28℃下培养，逐日观察，如最后一次冲洗液涂布的培养基中无菌落，在研磨液涂布的培养基中长出的菌落是内生菌，进行纯化培养后，4℃冰箱中保存备用。 

1.4拮抗活性测定 

番茄早疫病菌、番茄菌核病菌、黄瓜枯萎病菌活化培养，制成8mm的菌饼放置于PDA培养基中心，四周40mm处分别放置三片8mm大小含有内生细菌的滤纸片，置于28℃培养箱内培养4～5天，测量抑菌圈半径并计算抑菌率。 

1.5种子发芽试验