[发明专利]一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，涉及一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，更具体的说是一种通过抑制大豆异黄酮生物合成途径的关键酶-苯丙氨酸解氨酶PAL的活性，克服大豆遗传转化障碍、提高其农杆菌转化效率的方法。

背景技术

作物遗传转化常用的方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法由于穿透力强，包被在微弹中的外源基因借助轰击压力直接穿过细胞壁和细胞膜而进入植物基因组，从而实现外源基因转化的目的，因此基因枪法具有转化时间短、无宿主限制等优点。但适宜基因枪法的受体大多需要经过愈伤诱导、绿苗分化再生等繁琐的组织培养过程，而大豆的愈伤诱导、绿苗分化再生较难，因此目前很少用基因枪法转化大豆。农杆菌法是利用根癌农杆菌对植物的侵染特性把外源基因导入植物基因组的方法，因其拷贝数少、整合完整、遗传稳定以及受目的基因分子量限制小而广泛应用于植物的遗传转化。双子叶植物虽然是农杆菌的天然宿主，但直到1983年才由Pederson等证明了大豆可作为农杆菌的合适宿主。Hinchee等(1988)首次报告了农杆菌成功转化大豆的事例。自Hinchee等(1988)首次报道利用农杆菌转化大豆子叶节成功以来，因其不必经过愈伤组织的诱导过程，直接从子叶节部位的分生组织分化出芽，解决了大豆的离体再生难问题，使得农杆菌转化子叶节法成为最常用的大豆遗传转化方法。目前对农杆菌转化大豆的研究主要集中在选用强毒力菌株、构建高效表达载体、添加化学物质诱导VIR基因的高效表达、以及防止组织坏死提高T-DNA转移效率等方面，这些都是通过研究农杆菌转化大豆的外源物质或农杆菌本身等大豆外部因素来实现大豆遗传转化的，转化率低，而对于通过调节大豆内源物质降低对农杆菌侵染的抑制作用方面的研究未见报道。

大豆富含异黄酮，大豆异黄酮可调节复杂的植物/微生物互作(马君兰等，2007)，在动物上具有提高机体免疫力的功效。异黄酮类物质是由苯丙烷类代谢途径的一个分支所合成的，而苯丙氨酸解氨酶PAL是其生物合成途径的第一个关键酶，能够在转录和转录后水平对异黄酮的生物合成进行调控。有研究表明，苯丙氨酸解氨酶PAL抑制剂处理甘薯后几个小时内就可以检测到PAL酶活性的降低及下游代谢产物合成积累的受阻(王敬文等，1981)，而农杆菌一般在附着外植体16个小时后才开始T-DNA的转移(王关林等，1998)，这就为农杆菌转化大豆过程中人为调控PAL酶活性提供可能性和时机。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述技术缺陷提供一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法。本发明的原理是通过苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，抑制大豆异黄酮合成的关键酶PAL，减少大豆异黄酮类次生代谢产物的合成和积累，从而降低大豆外植体的“免疫力”，提高农杆菌的被侵染力，也就是说从改善植物/农杆菌互作关系方面提供了一种提高大豆遗传转化效率的方法。

本发明提供了一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于包括如下步骤：

①种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml 30％次氯酸钠和4ml浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24～36小时；

②种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B₅萌苗培养基中进行为期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培养；

③外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和上胚轴，保留0.5～2.0cm的下胚轴，用手术刀片对子叶节部位进行创伤处理；

④固体共培养基的制备：向经过121℃高压灭菌15min后的含有B₅大量元素、B₅微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、琼脂，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠，DTT，半胱氨酸，B₅有机成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；

⑤农杆菌侵染液的制备：将含有外源基因的重组农杆菌悬于含有1/10×B₅大量元素、1/10×B₅微量元素、1×B₅有机成分6-BA1.0mgL^-1、IBA 0.2mg L^-1、MES 3.9g L^-1、蔗糖30g L^-1，乙酰丁香酮AS200μM，PH 5.4的培养基中，调节菌液浓度到OD₆₀₀≈0.5，室温静置半小时备用；