[发明专利]利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用幼穗拯救获得转基因小麦的方法。

背景技术

转基因技术是利用异源基因进行种质资源创新的良好途径，但转化效率低下是限制转基因技术在小麦上应用的世界性难题。迄今为止，已报道的小麦转基因方法主要有花粉管法、基因枪法和农杆菌介导法。其中，花粉管法是利用小麦花粉萌发形成的花粉管通道，将外源基因导入受体。该项技术不需要愈伤组织的培养过程，相比于基因枪法既简单又经济，但因其重复性差，很难获得分子证据，在小麦上的应用越来越少。基因枪法是以金粉或钨粉作为载体，通过高压轰击受体组织将外源基因导入到受体细胞中，并实现基因整合。但基因枪法除了需要消耗昂贵的大载体、可裂膜、阻挡网等一次性耗材外，插入到受体细胞中的基因往往是随机整合，并且是多拷贝插入。因为小麦是异源六倍体，基因组非常庞大，多拷贝插入除了影响基因的表达效率外，转基因后代纯合较慢，难以迅速获得纯合株系。另外，筛选标记难以去除也是限制基因枪转化小麦的主要因素之一。农杆菌法则克服了上述两种方法的缺点，其原理是先用目标基因替换根癌农杆菌上的致癌基因，在农杆菌侵染受体材料时，目标基因被释放整合进入受体细胞，这种插入往往以单拷贝或低拷贝的形式发生，而且作为质粒复制所需要的筛选标记被留在受体细胞外，提高了转基因的安全性。

农杆菌介导法的上述优点，赋予它具有极大的应用潜力。但是农杆菌的天然寄主是双子叶植物，对许多单子叶植物侵染困难。近年来，通过科学家的不断努力，水稻、玉米、小麦等重要的单子叶植物的转化相继成功。就水稻而言，以明恢63成熟胚愈伤组织为受体的农杆菌转化，其效率已经达到90％。而农杆菌转化小麦效率低下仍然是一世界性难题。目前，通过农杆菌介导进行转化的方法主要有两种：一是农杆菌侵染幼胚、成熟胚及其诱导形成的愈伤组织，通过后续的愈伤诱导、筛选和再生获得转基因小麦，但农杆菌侵染后的愈伤组织，往往因为农杆菌的毒性而褐变，无法继续生长，造成转化效率低下。二是茎尖分生组织侵染法，即利用农杆菌侵染创伤的茎尖分生组织，不经过愈伤组织的筛选过程，直接收获种子，然后对获得的后代进行筛选和鉴定。在这个转化过程中，因为茎尖是一个高度分化的器官，其中只有部分细胞被转化，因此，转化体为转化细胞与非转化细胞共存的嵌合体，而且转化细胞最终发育成为可遗传器官的几率微乎其微。因此，单纯的茎尖转化法在转化当代(T₀代)检测的阳性比率高达75％，但是在T₁代中的比率极少。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育转基因小麦的方法，包括通过农杆菌介导将目的DNA转入小麦细胞的步骤，所述方法包括如下步骤：

1)将含有目的DNA表达载体的重组农杆菌接种于胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中，培养所述露白小麦种子获得处于雌雄蕊分化期的幼穗；

2)取步骤1)得到的处于雌雄蕊分化期的幼穗进行离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织，得到所述转基因小麦。

在上述方法中，步骤1)中所述接种是在所述胚芽鞘长为1.0mm-1.2mm的露白小麦种子的茎尖分生组织中注入1μL所述含有目的DNA表达载体的重组农杆菌菌液。

在上述方法中，所述重组农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.6。

在上述方法中，所述重组农杆菌菌液中含有乙酰丁香酮0.4mmol/L。

在上述方法中，所述农杆菌可为根癌农杆菌，具体可为根癌农杆菌EHA105。

在上述方法中，步骤2)中所述离体脱分化按照包括如下步骤的方法进行：将所述处于雌雄蕊分化期的幼穗接种于脱分化培养基中培养，获得愈伤组织。

在上述方法中，步骤2)中所述离体脱分化得到愈伤组织，保留含有所述目的DNA的愈伤组织后，还包括将所述含有所述目的DNA的愈伤组织接种于分化培养基中培养，获得具有根茎叶的小麦植株的步骤。

在上述方法中，所述脱分化培养基和所述分化培养基的基础培养基为MS培养基。

在上述方法中，所述脱分化培养基中含2.5mg/L 2，4-D和/或150mg/L特美汀和/或筛选转化体的抗生素，pH值为5.8；所述分化培养基中含2mg/L KT和/或筛选转化体的抗生素，pH值为5.8。

在上述方法中，所述分化培养基中培养的光照条件为：连续光照，所述连续光照的光照强度为1500LUX。