[发明专利]一种间日疟红内期疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种间日疟红内期疫苗及其制备方法，尤其涉及间日疟红内期疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。 

背景技术

自1907年Laveran A发现疟疾的病原体和Ross R 发现疟疾的传播媒介以来, 人们与这种疾病的斗争已进行了一个多世纪。迄今为止，疟疾仍然是一种严重威胁人类健康和生命的寄生虫病。据世界卫生组织2008年全球疟疾报告报道，2008年全球有2.43亿临床病例，86.3万人因疟疾死亡。由于疟原虫及蚊煤抗药性的产生和迅速扩散，疟疾的药物防治面临困境，因此，研制新型、高效、安全的疟疾疫苗成为当前的迫切需要。 

目前疟疾疫苗主要有红内期疫苗、红外期疫苗和传播阻断疫苗三种。在红内期疟原虫中, 由于裂殖子存在于细胞外，与宿主免疫系统直接接触, 因此这一时期原虫已成为红内期疫苗的主要靶点。裂殖子入侵宿主细胞是个相当复杂的过程, 并由受体和配体介导。推测有多个疟原虫蛋白质参与该入侵过程, 这些蛋白包括位于裂殖子表面的蛋白质、培养上清中可溶性蛋白质以及位于棒状体或微线体中的蛋白质，目前研究认为MSPs是疟疾疫苗研究靶点。长期以来，人们都把研究重点放在恶性疟的研究上，极少有人关注间日疟的研究。虽然在全球范围内恶性疟原虫引起的死亡人数比较多，但是间日疟原虫也是不容忽视的影响人们生活质量和经济生产力的原因之一。研究表明，间日疟裂殖子表面蛋白4(PvMSP4)在195个病毒株中的序列只有很少的不同，而且这些不同仅存在于两个重复序列结构中[Chaturong Putaporntip,Somchai Jongwutiwes, Liwang Cui. Limited Global Diversity of the Plasmodium vivax Merozoite Surface Protein 4 Gene.Infect Genet Evol. 2009 September ; 9(5): 821–826.]。 

杆状病毒表面展示系统是近几年发展起来的一种新的真核展示系统，通过在杆状病毒囊膜糖蛋白gp64插入外源蛋白，二者融合表达或与特异性的锚定部位结合，将外源蛋白展示在重组杆状病毒的表面，通过筛选表达特异蛋白的重组杆状病毒粒子得到外源蛋白，可用来展示需糖基化、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白及构建多肽文库、抗体库等。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种间日疟疾红内期疫苗，能够对间日疟原虫的攻击感染提供免疫保护。 

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5605。

上述重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4的制备方法，包括以下步骤： 

 (1)基因PvMSP4(间日疟裂殖子表面蛋白4的编码基因)的获得：为了去除基因中的内含子，根据NCBI上PvMSP4基因序列(基因登录号：GQ912373.1)设计两对引物，所述PvMSP4基因序列由中间的一个内含子将其分成外显子1和外显子2，利用外显子1的下游引物和外显子2的上游引物引入相同的BamH I酶切位点，基因序列由GGTAGC转变成GGATCC，但是编码的氨基酸序列不变；以间日疟原虫Tv159病毒株的基因组DNA为模板，通过PCR扩增两段基因后分别进行双酶切，并用连接酶连接后作为模板，利用外显子1的上游引物和外显子2的下游引物PCR扩增获得基因PvMSP4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

(2)重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4的构建：将步骤(1) 经PCR所得完整的PvMSP4基因(全基因)插入杆状病毒表面展示载体pFastBacI-gp64中，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，挑斑提取重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4，并用PCR和双酶切进行鉴定；