[发明专利]一种间日疟红内期疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5605。

2.一种权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1) PvMSP4基因的获得：根据NCBI上基因登录号为GQ912373.1的PvMSP4基因序列设计两对引物，所述PvMSP4基因序列由中间的一个内含子将其分成外显子1和外显子2，利用外显子1的下游引物和外显子2的上游引物引入相同的BamH I酶切位点，基因序列由GGTAGC转变成GGATCC，但是编码的氨基酸序列不变；以间日疟原虫Tv159病毒株的基因组DNA为模板，通过PCR扩增两段基因后分别进行双酶切，并用连接酶连接后作为模板，利用外显子1的上游引物和外显子2的下游引物PCR扩增获得基因PvMSP4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

(2)重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4的构建：将步骤(1) 经PCR所得完整的PvMSP4基因插入杆状病毒表面展示载体pFastBacI-gp64中，转化大肠杆菌 TG1感受态细胞，挑斑提取重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4，并用PCR和双酶切进行鉴定；

(3)重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4的获得与鉴定：将步骤(2) 鉴定成功的重组供体质粒pFastBacI-gp64-PvMSP4转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过转座方式进行蓝白斑筛选，抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物PCR 进行鉴定；将鉴定成功的重组杆状病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN 细胞，待细胞发病后收集第一代重组病毒悬液0-4℃保存，提取病毒基因组并用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中外显子1的上游引物含EcoR I，外显子2的下游引物含Xho I；且外显子1、外显子2、外显子1的上游引物、外显子1的下游引物、外显子2的上游引物、外显子2的下游引物的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中杆状病毒表面展示载体pFastBacI-gp64由PCR扩增得到的杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列、杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列克隆至转移载体pFastBacI中获得。

5.一种权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

6.一种权利要求5所述蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64-PvMSP4感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

(2)针刺接种法接入家蚕五龄幼虫和蚕蛹；

(3)收集表达的权利5所述蛋白。

7.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-PvMSP4在间日疟红内期疫苗制备中的应用。

8.一种权利要求5所述蛋白在间日疟红内期疫苗制备中的应用。