[发明专利]家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

一种家蚕质型多角体病毒(BmCPV)荧光定量PCR检测方法，属生物技术领域。 

背景技术

家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，是危害养蚕业的主要病原物之一，给生产上造成了巨大经济损失。BmCPV病毒粒子直径约为50-65nm，形状呈正二十面体，具有独特的单层衣壳结构。基因组由10节段双链RNA分子组成，目前把质型多角体病毒按照电泳迁移率的不同分成14个电泳型，BmCPV属I型。其宿主域主要是鳞翅目，双翅目，膜翅目和鞘翅目等昆虫。BmCPV专一性感染家蚕中肠上皮细胞，感染了BmCPV的家蚕中肠上皮细胞的主要细胞器均发生显著病变。家蚕表现为发育不良、体形瘦弱、行动呆滞。随着病程的推进，在中肠后部可看到白色的褶皱，这是家蚕质型多角体病的典型病症之一。中肠乳白色的病变是家蚕质型多角体病肉眼诊断的重要依据之一。 

目前对家蚕质型多角体病的防治尚未取得突破性进展，生产上主要以预防为主。家蚕病毒病的诊断技术相对落后，主要通过对典型症状的肉眼判断为主。虽然，也有学者尝试利用其它诸如血清学方法、酶联抗体-ELISA法、胶乳凝集反应和单克隆抗体法用于家蚕病毒病的诊断，但这些检测方法有的准确性低、有的无法定量，有的操作烦琐等，均没有形成体系化、稳定化的检测方法，很难在实际诊断中推广应用。经对现有发明专利检索发现，刘吉平等(专利号：CN102154522A，2011年)采用常规PCR方法检测BmCPV。常规PCR方法扩增后需电泳检测，易造成PCR产物污染及环境污染，不能定量，且不适合高通量检测。荧光定量PCR将常规PCR和荧光检测相结合，仪器自动分析，高通量，无后续处理，具有高灵敏性、高特异性、重现性好，且可以对样品中的病毒含量进行准确定量，已成为病毒检测的重要方法。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法。本发明检测灵敏度可达10¹个数量级拷贝的病毒分子，具有灵敏性高、稳定性高、可以定量，特异性好，假阳性低等特点。 

本发明通过以下技术方案予以实现，步骤如下： 

步骤一，以家蚕质型多角体蛋白基因的保守序列为靶目标，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，扩增目的基因片断(SEQ ID No：1)。所述特异性引物为： 

正向引物：5′ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3’， 

反向引物：5′ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3’。 

步骤二，构建含目的基因片断的定量标准质粒，所用载体为pGEM-T Easy； 

步骤三，提取样品RNA，反转录合成cDNA； 

步骤四，实时荧光定量PCR扩增及标准曲线的建立。PCR反应体系为：95℃预变性3min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。 

本发明的有益效果为：与RT-PCR相比，本发明的方法无需扩增后电泳分析，避免了PCR产物污染及制胶过程中的健康损害；本发明的方法具有灵敏性高、稳定性强、特异性好及可以准确定量等特点；本发明可同时进行大批量样品的检测，具有高通量性；本发明方法检测范围广，在10¹-10⁷拷贝范围内具有良好的线性关系，检测范围可达7个数量级。 

附图说明

图1家蚕质型多角体病毒绝对定量的标准曲线图。 

图2家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR扩增曲线图。 

具体实施方式

下面结合具体实例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商所建议的条件；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。 

实施例 

步骤一，设计特异性引物 

从基因数据库中检索获得家蚕质型多角体蛋白基因序列(登录号为AB003361)，利用Primer Premier 5.0软件设计得到一条特异性引物，目的扩增片段为118bp(SEQ ID NO：1)。设计的引物序列为： 

正向引物：5′ATACAAGGTTGGCATTTCAGA 3’，(SEQ ID NO：2)

反向引物：5′ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT 3’。(SEQ ID NO：3)