[发明专利]用于检测HIV-1分化体及逆转录酶和蛋白酶区的重组体的系统和方法

说明书

发明领域

本发明提供用于检测和分析与HIV-1有关的序列变体、特别是HIV分化体A、B、C、D、F和G及其相关重组体的序列变体的方法、试剂和系统。本文所用术语“分化体”总的来讲具有与相关领域普通技术人员所理解的相同含义，是指通常存在于特定地理区域的HIV-1病毒的遗传独特亚群。例如在欧洲，约75%的HIV感染为HIV-B (即分化体B)感染，约25%由HIV-A、HIV-C和其它分化体群组成。

变体可包括在平行的靶多核苷酸群体中的单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失变体(称为“indel”)和等位基因频率。本发明还涉及通过平行焦磷酸测序研究通过聚合酶链式反应(PCR)复制的核酸以鉴定已知和未知序列的突变和多态性的方法。本发明包括使用特别设计的核酸引物，以扩增与特定HIV特性或功能有关的HIV RNA或其互补DNA的特定区和/或一系列重叠区，例如分别与HIV将病毒RNA转录成双链DNA (dsDNA)以备整合至宿主细胞中和适当装配/使病毒多蛋白成熟以产生感染性病毒粒的能力有关的逆转录酶(RT)和蛋白酶(Prot)区。此外，引物的靶位点具有低突变率，使得疑似含有变体(亦称为准种)的靶HIV核酸群中的核酸能够稳定扩增以产生各自的扩增子。以大量平行、有效和有成本效益的方式，对数千独特的HIV扩增子进行测序，以产生扩增子群中存在的序列变体的分布，这使得高于先前所用方法的更大检测灵敏度成为可能。

发明背景

人免疫缺陷病毒(一般称为HIV)依然是世界范围的主要问题，尽管许多化合物获准用于治疗。由于病毒逆转录酶的易错性质和高病毒周转(t? = 1-3天)所致，HIV基因组突变得非常快。鉴于在其9.7 Kb基因组复制期间的高突变率，‘准种’的形成导致以动态关系存在的许多不同的突变体。

HIV RT基因编码序列位于pol区的5’端附近，在基因组中两侧是Prot区和RNA酶区——前者具有部分重叠的读框，该读框始于gag基因的p6蛋白的3’端。RT蛋白由440个氨基酸(51 kDa)编码，其主要功能产生于作为异二聚体的组合，所述异二聚体具有由560个氨基酸(66 kDa)编码的RT/RNA酶H多蛋白。它包括3个主要的酶功能：1)使互补DNA链与基因组RNA聚合，2)使亲本RNA链降解，留下由酶的逆转录酶活性产生的互补DNA，和3)产生第一链的第二互补链，从而通过聚合酶活性产生dsDNA原病毒(Lu等, J. Biol. Chem. 279 (2004) 54529-54532，其通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的)。

对于任何HIV-1病毒基因，引物设计的一个主要困难是因为这种酶的保真度低，这就导致甚至在病毒RNA至dsDNA的单一RT转化中的高频率突变。文献指出HIV-1 RT在单条DNA链聚合期间引起1/2000-1/4000的取代差错频率(substitution error frequencies)。由于第一链和第二链相继聚合，因此对于各HIV-1基因组转化，这些出错率可相当于每轮复制共5-10个突变(Preston等，Science 242 (1988) 1168-1171)。这种突变的dsDNA病毒基因组然后整合到宿主生物将要全体复制的染色体中，用于感染并随后整合到其它宿主细胞中。针对逆转录酶功能的药物是减少病毒繁殖的极好靶标，因此，FDA批准了适于以下两种类别的药物：核苷/核苷酸类似物逆转录酶抑制剂(NRTI/NtRTI)和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)，两者靶向逆转录酶，但却通过不同方式靶向逆转录酶。