[发明专利]调控寡核苷酸功能性的方法

说明书

技术领域

本发明一般涉及调控寡核苷酸功能性的方法，并且更具体地，涉及调控引物或探针的功能性的方法。本发明所述的方法设计以提供使寡核苷酸(如引物)的功能性选择性失活或激活的方式，借此提供调控使用该寡核苷酸的任何方法的过程的方式。调控寡核苷酸(如引物)的功能性的方式的开发在一定范围的应用中有用，其包括(但不限于)扩增反应，如PCR、等温扩增和核酸链延伸。对于扩增反应来说，这些具有广泛应用，其包括以特定基因序列为特征的疾病病况的诊断和/或监控以及感兴趣的特定基因区的表征或分析。

背景技术

在本说明书中，对任何在先出版物(或者来源于该出版物的信息)或者对任何已知事物的参考不是也不应认为是对在先出版物(或者来源于该出版物的信息)或已知事物构成本说明书所涉及的领域中一般常识的一部分的承认或许可或任何形式的建议。

在说明的最后以字母顺序列出了在本说明书中作者所引用的出版物的文献目录的详细内容。

聚合酶链反应(PCR)是用于扩增DNA链特定区域的技术。这可以是单个基因、仅基因的一部分或非编码序列。大多数PCR方法通常扩增最多10个千碱基对(kb)的DNA片段，即使一些技术使得能够扩增最多40kb大小的片段(Cheng等人，1994，Proc Natl Acad Sci.91：5695-5699)。

如目前所实行的，PCR需要几个基本组分(Sambrook和Russel，2001，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版)。这些组分是：

·含有待扩增的DNA片段区的DNA模板；

·寡核苷酸，其用作引物并且与待扩增DNA区的5’和3’端的DNA区互补；

·DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶或最适温度在约70℃的另一种热稳定的DNA聚合酶)，其用于合成待扩增区的DNA拷贝；和

·三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，DNA聚合酶由其制备了新DNA。

PCR是在插入到热循环仪中的含有通常为15-100μl的反应体积的小反应管(0.2-0.5ml体积)中进行的。该机器将在其中的反应管加热和冷却至反应每个步骤所需的精确温度。大部分热循环仪包括加热的盖子以防止反应管帽内部上的冷凝。可选择地，可以将油层置于反应混合物上以防止蒸发。

因此，PCR是使得较长DNA分子内的DNA序列能够以指数扩增的方法。该反应包括多个扩增循环并且在每个循环中每个分子反应的模板是样品中初始DNA链或者在先前循环中合成的DNA链。每个PCR循环包括以下步骤

-通过加热变性使DNA双螺旋的两条链分离

-使上游和下游引物与它们的互补序列杂交

-通过DNA聚合酶使引物延伸以产生模板序列的互补拷贝

通常，选择PCR试剂和条件从而使变性、杂交和延伸以接近最高效率发生并因此所需序列的量随每个循环以接近2的倍数增加。在PCR结束时，发生了大量扩增，例如，30个循环的PCR将导致原始模板扩增几乎2³⁰(1,000,000,000)倍。这种程度的扩增有利于扩增产物的检测和分析。

在多个扩增循环后，可以终止PCR并以多种方式分析产物，最常见地，通过凝胶电泳分析。当使用固定循环数进行PCR时，扩增产物的量通常不与进料靶DNA的量密切相关，并且这类PCR只是用于检测特定DNA存在或不存在和/或用于为进一步分析提供足够的靶DNA的定性工具。

为了测量信使RNA(mRNA)，该方法使用反转录酶以初始地将mRNA转化为互补DNA(cDNA)，随后通过PCR扩增所述互补DNA并通过琼脂糖凝胶电泳分析。反转录紧接终点PCR(end-point PCR)基本上是类似的定性技术。

为了提供定量能力，开发了实时PCR。该程序遵照PCR的一般模式，但是在每个循环期间对扩增的DNA进行定量。两种常见的定量方法为嵌入双链DNA的荧光染料和其荧光在PCR的一个步骤期间会发生变化的修饰的DNA寡核苷酸引物或探针的使用。经常地，实时聚合酶链反应与反转录酶聚合酶链反应结合以定量低丰度信使RNA(mRNA)，从而使研究人员能够定量特定时间或者特定细胞或组织类型中的相对基因表达。

(i)使用与双链DNA结合的染料的实时PCR