[发明专利]靶向免疫融合蛋白的构建、表达和纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体而言，本发明涉及靶向免疫融合蛋白的生产方法，包括表达载体的构建、真核表达过程以及纯化方法。

发明背景

原癌基因HER2/neu，又名ErbB2，是膜受体中具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族的第二号成员。ErbB2通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达，然而在人类多种恶性肿瘤中却过度表达，如乳腺癌(25-30％)、卵巢癌(25-32％)、肺癌(30-35％)、原发性肾细胞癌(30-40％)等，同时研究发现，HER2的过度表达通常预示着癌症恶变率高或预后差(Slamon DJ，Godolphin W，Jones LA，et al.(1989)Studies of the ErbB2/neu Proto-oncogene in Human Breast and Ovarian Cancer.Science，244(4905)：707-712.)。

研究认为，HER2高表达的癌细胞发生是由于ErbB2蛋白与其家族成员(EGFR、ErbB3、ErbB4)形成的异二聚体诱导酪氨酸激酶活化，激活受体胞内部分(C端)酪氨酸残基发生自身磷酸化，然后激发细胞内信号级联反应，导致下游信号分子的激活，刺激细胞增殖、发育、分化、迁移及瘤细胞形成(Alroy I，Yarden Y.(1997)The ErbB Signaling Network in Embryogenesis and Oncogenesis：Signal Diversification through Combinatorial Ligand-receptor Interactions.FEBS Lett，410：83-86.)。目前，国内外生产销售HER2过表达的抗癌药物是以阻断HER2异二聚体的形成或信号发生为靶点的单克隆抗体药物或小分子酶类抑制剂。

众所周知，尽管单克隆抗体药物的临床应用使部分HER2过表达的癌症患者获得治疗，但是其客观有效率并不高，加上其费用高昂，因此，需要开发针对HER2/neu的新机制药物并提供比目前人癌症治疗效果更佳、更安全、毒性更小的药物成为同行们期盼的目标(J.-L.Merlin，M.Barberi-Heyob&N.Bachmann。(2002)In vitro comparative evaluation of trastuzumab combined with paclitaxel or docetaxel in HER2-expressing human breast cancer cell lines.Annals of Oncology 13：1743-1748)。

靶向免疫融合蛋白作为HER2/neu的新机制药物，以其用药量少、费用低、毒性更小而成为未来的主导药物之一(Ming Shi，Zhigang Xie，Jiannan Feng，Yingxun Sun，Ming Yu，Beifen Shen&Ning Guo.(2003)A recombinant anti-erbB2，scFv-Fc-IL-2fusion protein retains antigen specificity and cytokine function.Biotechnology Letters 25：815-819)、(Jessica M.，Manuela K.，EvelineT.，Roberto S.，Stuart H.，Camilla B.，Leonardo G.，and Dario N.(2008)Antibody-Mediated Delivery of Interleukin-2to the Stroma of Breast Cancer Strongly Enhances the Potency ofChemotherapy.Clin Cancer Res；14(20)October15.)。它是根据药物的作用特点和生物学活性需求不同将抗体和某些药物进行基因重组，然后，再利用质粒转染技术在细胞或细菌中表达，经过纯化而获得的高纯度融合蛋白，即“生物导弹”，其特点是：(1)具有抗体的二聚体结构，增加了融合蛋白的分子量，提高其在体内的半衰期；(2)可利用抗体的靶向特性可将融合蛋白招募到靶细胞周围，发挥融合蛋白中诱导免疫杀伤等功效的多肽功。