[发明专利]靶向免疫融合蛋白的构建、表达和纯化方法

权利要求书

1.靶向免疫融合蛋白或其突变体的生产方法，其包括，构建选自pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR和pCI-VCI^125S-DHFR的真核表达载体，培养转染了该真核表达载体的真核细胞，然后纯化培养获得的上清液，其中纯化的过程包括进行阴离子交换层析、亲和层析、和分子筛层析。

2.权利要求1的生产方法，其中，

(a)pCI-VCI-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P2PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI-DHFR；

(b)pCI-VCI^125A-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2 PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2 PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4 PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P3 PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI^125A-DHFR；或者，

(c)pCI-VCI^125S-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2 PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2 PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4 PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P4 PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI^125S-DHFR。

3.权利要求1的生产方法，其中靶向免疫融合蛋白或其突变体由选自SEQ ID NO：1-3之一所示的核酸序列编码。

4.权利要求1的生产方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，最优选是CHO/dhfr-细胞株。

5.权利要求1的生产方法，其中培养是在28～35℃(优选是29～32℃，最优选是30℃)的条件下培养。

6.权利要求1的生产方法，其中纯化的过程依次包括将培养获得的上清液进行离心、过滤、透析、阴离子交换层析、亲和层析、任选的过滤、和分子筛层析。