[发明专利]一种产耐有机溶剂脂肪酶的菌株、耐有机溶剂脂肪酶及其制备方法

权利要求书

1.一种脂肪酶产生菌，分类命名为枝孢霉(Cladosporium sp.)，保藏编号为CGMCC No.4962。

2.一种生产脂肪酶的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：在适合生产的情况下，于25-32℃培养如权利要求1所述的脂肪酶产生菌，从而使该菌株产生脂肪酶；从培养基中分离出脂肪酶。

3.根据权利要求2所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于28℃培养如权利要求1所述的脂肪酶产生菌。

4.根据权利要求2所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于该方法以如权利要求1所述的脂肪酶产生菌为原料，由以下步骤组成：

(A)菌株于25-32℃，120-250rpm下于发酵培养基中培养64-72小时，发酵培养基的配方如下：蔗糖0.1-5％、蛋白胨0-10％、玉米粉0-5％、酵母浸出粉0-5％、吐温-800-3％、滑石粉0-2％、NaNO₃0-1％、KH₂PO₄0.7％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.25％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％、橄榄油0-5％，pH6.5；

(B)发酵液过滤除去菌丝体，滤液采用5-30kDa的膜进行超滤浓缩，对浓缩液进行硫酸铵盐析，收集30-60％饱和度的盐析沉淀物；

(C)用疏水层析柱对盐析产物进行层析纯化，先用浓度为20-100mM的，pH6.0-8.5缓冲液进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，最后用10-70％的乙醇水溶液洗脱并收集该洗脱组分；经过缓冲液置换后用离子交换层析纯化，收集主要的脂肪酶活性峰经过缓冲液置换后即可。

5.根据权利要求4所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(A)为25-32℃，120～250rpm下于发酵培养基中培养64-72小时，发酵培养基的配方如下：蔗糖2％、蛋白胨3％、玉米粉0.5％、酵母浸出粉1％、吐温-800.5％、滑石粉0.1％、NaNO₃0.3％、KH₂PO₄0.7％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.25％、MgSO₄·12H₂O 0.1％、CaCl₂0.05％、橄榄油0.5％，pH 6.5。

6.根据权利要求4或5所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(A)中菌株于28℃，200rpm下于发酵培养基中培养64-72小时。

7.根据权利要求4或5所述的一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(B)中发酵液收集后用滤纸进行过滤，收集的清液经过0.22μm的微孔滤膜过滤进一步澄清后，再用10kDa的超滤膜进行超滤以浓缩。

8.一种如权利要求2-7任一方法制备得到的脂肪酶，其特征在于该脂肪酶分子量为40-60kDa，对甲醇、乙醇或丙酮具有耐受性。