[发明专利]一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法

说明书

技术领域

本发明涉及种子组织的取样方法。

背景技术

随着现代分子生物学发展，高通量测序技术及分子标记得以迅速应用，但目前还没有与之相配套的简易高通量取样技术，限制了该技术的发展。许多研究如数量遗传性状定位、植物数量性状基因克隆以及分子育种，均需要从种子大量提取DNA，进行基因型鉴定，从而选择出有用的基因型个体，淘汰不需要用的基因型个体。传统的从种子中来提取DNA的方法如“半粒种子法”，是一个非常复杂与繁琐的过程，不能满足现化高通量提取DNA的要求。另一方面，虽然美国孟山都公司的专利产品自动无污染种子取样器(中国专利公开号CN101437391)，可以用于种子取样技术，但是由于该机器的价格十分昂贵，不利于推广使用。最接近的方法为“钻孔法”(Kamiya and Kiguchi 2003，Rapid DNA Extraction Method from Soybean Seeds，Breeding Science 53(3)：277-279)，但是其操作程序复杂，钻取单个种子费时间较长，钻取的植物组织采用玻璃纸、1.5毫升离心管或2.0毫升离心管收集，不适于高通量样品的连续采集。

发明内容

本发明是要解决现有的种子取样器价格昂贵，不利于推广使用，以及现有的“钻孔法”操作复杂，不适于高通量样品连续采集的问题，而提供一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法。

本发明一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法按照以下步骤完成：

一、准备材料：植物种子、钻头、可调速台钻、孔板、移液管枪头、空气压缩机、铝箔纸；用双层铝箔纸将孔板上口处包裹严密，用胶带将铝箔纸边缘固定在样品板上，轻压铝箔纸，使孔板的样品孔轮廓凸现；

二、钻孔、收集胚乳组织：将可调速台钻放置于操作台上，安装上钻头，钻孔的位置选取植物种子上远离胚胎的一侧，使钻头不破坏种子胚胎，钻头转速为200～400r/min，最初钻取的表皮部分弃去，钻至胚乳组织时，使用移液管枪头收集，移液管枪头小头的一端用带有乳胶手套的手指按住，将钻取的胚乳组织从移液管枪头大头一端倒入移液管枪头中，钻孔后的种子编号存放；

三、转移胚乳组织，将步骤二中盛有胚乳组织的移液管枪头倾斜，使移液管枪头与水平面呈10～30度角，移液管枪头小头一侧位于低处，移开按住移液管枪头小头的手指，用移液管枪头的小头将铝箔纸刺破，将移液管枪头插入孔板的样品孔中，然后直立移液管枪头，使胚乳组织流入到孔板的样品孔中；

四、清洗，用空气压缩机吹出的高压空气将步骤二和三中使用的移液管枪头、钻头和乳胶手套上沾有的胚乳组织吹走；

五、重复步骤二至四，直至完成所有种子的取样。

本发明方法使用移液管枪头收集钻取的种子组织材料，并转移至孔板中，转移后利用高压气流清除所用共具上的残余样品后，进行下一个种子的取样。整个过程简单、高速。收集的种子组织材料用于进行基因型鉴定及其它下游分析。钻取后的种子编号存放，可用于科研与育种中。

本发明的有益效果：本发明一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，只需利用简单的设备即可实现连续钻取、收集种子组织样品，同时保持种子的发芽势，钻取的种子组织并不需要粉碎，可以直接用于高通量的DNA基因型鉴定。本发明方法效率高，每人每日钻取的植物种子组织样品为4～6块384样品板，相当于大豆种子1500～2300粒，与现有的钻孔法相比，效率提高了7.5～11.5倍。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法按照以下步骤完成：

一、准备材料：植物种子、钻头、可调速台钻、孔板、移液管枪头、空气压缩机、铝箔纸；用双层铝箔纸将孔板上口处包裹严密，用胶带将铝箔纸边缘固定在样品板上，轻压铝箔纸，使孔板的样品孔轮廓凸现；

二、钻孔、收集胚乳组织：将可调速台钻放置于操作台上，安装上钻头，钻孔的位置选取植物种子上远离胚胎的一侧，使钻头不破坏种子胚胎，钻头转速为200～400r/min，最初钻取的表皮部分弃去，钻至胚乳组织时，使用移液管枪头收集，移液管枪头小头的一端用带有乳胶手套的手指按住，将钻取的胚乳组织从移液管枪头大头一端倒入移液管枪头中，钻孔后的种子编号存放；