[发明专利]携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白及其重组表达方法与应用

权利要求书

1.携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白，是在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的氨基(N)端连接有折叠酶DsbA的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述DsbA自氨基端与氧化还原功能相关的两个半胱氨酸(Cys)突变成丝氨酸(Ser)。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No：1；

2)将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有丝氨酸蛋白酶活性和RNA解旋酶活性的蛋白质。

4.编码权利要求1或2或3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，编码权利要求3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID No：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

6.含有权利要求4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

7.一种重组表达权利要求1或2或3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的方法，是将含有权利要求4或5或6所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主中，经表达、纯化得到携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白；

所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因采用转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到，用于扩增该基因的上、下游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示。

8.根据权利要求7所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的重组表达方法，其特征在于，用于构建含有上述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体的出发载体为任意一种携带折叠酶DsbA基因的原核表达载体pET-DsbA；以pET-DsbA为出发载体构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体为pET-DsbA-NS3；所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因位于原核表达载体pET-DsbA多克隆位点处的BagII和Nhe I限制性酶切位点之间。

9.根据权利要求7或8所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白的重组表达方法，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体为BL21(Rosetta)、BL21(DE3)、BL21(DE3，plysS)、E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Topl0，优选为BL21(Rosetta)；以大肠杆菌BL21(Rosetta)为出发菌株构建的含有携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白编码基因的重组表达载体pET-DsbA-NS3的工程菌为BL21(Rosetta)/DsbA-NS3。

10.权利要求1或2或3所述携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白NS3优势区的融合蛋白在牛病毒性腹泻病毒的ELISA检测中的应用。