[发明专利]一种具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从人外周血或脐带血中分离单个核细胞(PBMC)，并且通过17-20天的时间以最为简单的方法获得具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞。

背景技术

肿瘤一直以来几乎是死亡的代名词。虽然医学以及生物学界围绕着肿瘤的发生、机理以及治疗等方面进行了大量的工作，但是目前为止最为主要的治疗方式还是放化疗。但是对于患者而言放化疗无异于饮鸩止渴，患者不仅需要付出高额的治疗费用并且还要忍受副作用所带来的巨大痛苦，而更为可悲的是这一痛苦的过程只不过是延缓死亡而已。因此，相关专家学者越来越清楚地认识到攻克肿瘤应该寻找另一条路线。

细胞治疗并不是近几年才受到关注的，从早期的NK细胞、树突状细胞直到现在的细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)以及多种细胞的联合应用细胞治疗已经发展成为一个非常有希望的手段并越来越受到重视。

其中，CIK细胞由于其增殖能力强、细胞毒作用强、兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，并且对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

CIK细胞的特点：

1、增殖能力强，主要效用细胞CD3+CD56+可增殖1000倍；

2、杀伤活力强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子γ干扰素、白细胞介素2等；

3、杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用，对多重耐药肿瘤细胞仍敏感，杀瘤活性不受环孢素A(CsA)和FK506等免疫抑制剂的影响，能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。

4、毒副作用小，无严重不良反应。

CIK细胞治疗技术的优势：

1、可有清除手术、放化疗后残余的癌细胞及微小病灶，预防肿瘤的复发和转移；

2、可与放、化疗联合使用，能降低放化疗的毒副作用的感染率，提高放化疗的疗效；

3、可用于放、化疗无效的患者，或对化疗药物产生耐药性的患者的治疗；

4、对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者，能迅速缓解其临床症状，延长生存期；大部分患者出现瘤体减小甚至消失或长期带瘤生存的治疗效果；

5、由于CIK细胞具有免疫调节和体细胞修复作用，在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽，黑斑淡化，静脉曲张消失，脱发停止甚至头发生长或白发变黑等“年轻化”表现，及精神状态或体力明显恢复等现象，从而提高肿瘤患者的生存质量，延长生存期。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一套简单、高效、可重复性好的具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，利用密度为1.084的Ficoll单核细胞分离液于PBS系统中分离外周血或脐带血单个核细胞，并且通过17-20天的诱导培养获得CIK细胞。

Ficoll、外周血或脐带血、PBS混合体积比为1∶1∶1。

单个核细胞分离离心参数为：离心力250g，离心时间40分钟。

所述具有肿瘤细胞杀伤作用的CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)临床获取外周血或脐带血，利用密度为1.084的Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞；

(2)D0天利用初始诱导培养基培养；D1天加入抗CD3抗体，IL-2；以后每三天补加基础培养基、自体血清和IL-2；第19天获得足量CIK细胞；

(3)对获得CIK细胞进行表面标志物检测和杀伤活力检测。

按体积比浓度计，所述初始诱导培养基为淋巴细胞基础培养基98％、自体血清浓度为1％、双抗1％、IFN-γ浓度为2000u/ml；CIK维持培养基为淋巴细胞基础培养基98％、自体血清浓度为1％、双抗1％、IL-2浓度为1000u/ml。

所述双抗为青霉素和链霉素。