[发明专利]一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒以其制备方法

权利要求书

1.一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于：所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分：

1）包被微球：微球主要包括两类，一种直径为5.6μm的聚苯乙烯微球和另一种6.5μm的磁性微球，上述两类微球分别包被了ox-LDL捕获抗体的微球、包被了sCD40L捕获抗体的微球、包被了MMP-9捕获抗体的微球、包被了TF捕获抗体的微球、包被了omentin捕获抗体的微球和包被了esRAGE捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；

2）生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3）链亲合素藻红蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于：每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120-130个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-4μg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括有如下步骤：

1）按照上述试剂盒的组成，制备相应的抗体包被微球：

分别选取不同的微球，经涡旋或超声悬浮20-25秒；将50μl微球活化后，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；

吸去上清，将微球重悬于250μl 50mM的MES的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；重复该步骤一次；

吸去上清，将微球重悬于100μl 50mM的MES的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，加入1μg的抗体，用50mM的MES的溶液将总体积补至500μl；

经涡旋震荡混匀，室温避光振荡3小时；离心收集偶联抗体的微球，离心条件为≥8000g，离心2-3分钟；

吸去上清，将微球重悬于500μl的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；

吸去上清，将微球重悬于1ml的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集微球，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟重复该步骤一次；

吸去上清，将微球重悬于600μl的PBS-TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2-8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合；

2）进行每种检测抗体的生物素标记：依据蛋白浓度计算反应体系：计算将抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，为目标体积（V），配制NHS-Biotin反应液（用DMSO溶解，终浓度为10mg/ml）；按摩尔比1：100的比例在反应管中分别加入检测抗体和N-Biotin反应液；加入1/10V的碳酸氢钠溶液（pH8.9）；加入PBS溶液补至目标体积；

包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周震荡器上，于25度恒温箱中避光孵育5小时，转速为1000rpm；

将反应管中的液体转至透析卡中，于1000倍体积的 PBS缓冲液中透析过夜两次，以去除未反应的NHS-Biotin，测定蛋白浓度。

4.根据权利要求3所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于：所述活化微球的步骤如下：

用涡旋振荡器或者超声波悬浮微球；

取50μl微球离心收集沉淀，离心条件为≥8000g ，离心1-2分钟；

去掉上清液，将微球悬于100μl的双蒸水中，用涡旋振荡器或者超声波悬浮微球20-25秒，离心收集沉淀，离心条件为≥8000g，离心1-2分钟；

吸弃上清，加入80μl的磷酸盐缓冲液（pH6.2），涡旋振荡20-25秒，超声波悬浮微球20-25秒；

加入10μl 50mg/ml的N-羟基硫代琥珀酰亚胺（S-NHS），用涡旋振荡器轻轻地混匀；

加入10μl 50mg/ml的1-乙基-（3-二甲基氨基丙级）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），用涡旋振荡器轻轻地混匀；

室温避光静置20min，每10分钟使用涡旋振荡器轻轻地混匀。