[发明专利]含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种后代真实性的分子鉴定方法。 

背景技术

杂种优势的研究和利用可显著提高棉花的产量、改进品质、提高抗性。我国育苗移栽地区的绝大部分棉农栽种杂交棉；黄河流域棉区，甚至新疆等直播棉区也正在大力发展杂交棉。目前棉花杂交种子的生产方式主要是人工去雄授粉杂交制种法，棉花生产上种植的杂交种子90％以上都是通过这种方式生产的。然而随着棉花主要生产区及其周边地区劳动力成本逐年提高，种子生产成本越来越高，大规模推广利用难度也愈来愈大。因此，开展三系杂交棉选育和推广工作就显得尤为重要。与其它制种方式相比，三系杂交棉具有明显的优势：制种程序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40％，种子纯度高，适合大面积制种。因而，三系杂交棉花的大面积推广，对于提高植棉效益，增加棉农收益，稳定棉花种植面积都具有重要的意义。基于三系杂交种在制种方式特殊性的考虑，为了确保三系杂交种的真实性，如何稳定可靠又快速简便的鉴定三系杂交种成为本专利的关键核心。 

DNA是生物的基本遗传物质，DNA多态性是生物多样性的本质内容。分子标记直接从分子水平反映出核苷酸序列的任何差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，数量非常丰富，遗传稳定。分子标记的检测技术多种多样，新的方法不断产生，已有几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP、CAPS和 SNP等，随着分子标记技术的不断发展和应用，目前，国内外在植物杂交种鉴定中已经越来越多的应用各种分子标记技术。SSR(simple sequence repeat)也称为微卫星，是由基因组中1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA。在所有真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，不仅存在于内含子中，也可以存在于编码区以及染色体的其它任何区域，具有多态性丰富、稳定性好、位点专一性、共显性等特点。序列特异扩增区域(Sequencecharacterized amplified regions，SCAR)标记是由Paran等于1993年提出的一种基于PCR技术的单基因位点多态性遗传标记，由于使用较长引物和引物序列与模板DNA完全互补，在高严谨条件下扩增，结果稳定性好、重复性强。该方法对于目的基因具有很好的辅助选择效果，已成为分子标记在育种实践中直接应用的首选方法。 

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花三系杂交种真实性的田间鉴定检测方法所需时间长，消耗大、准确性差等的问题，提供一种棉花三系杂交种真实性的分子鉴定方法。 

为了实现上述的目的，本发明首先提供一种用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。 

本发明以含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花不育系和保持系为研究材料，通过对10个线粒体基因的RFLP和Genomewalking的分析，从不育系atpA基因侧翼序列中分离到可能与棉花细胞质雄性不育相关的一段约500bp的特异片段(见参考文献WuJianyong，Gong Yangcang，Cui Minghui，Qi Tingxiang，Guo Liping，Zhang Jinfa and Xing Chaozhu.Molecular characterization ofcytoplasmic male sterility conditioned by Gossypium harknessii cytoplasm(CMS-D2)in upland cotton[J].Euhpytica，DOI：10.1007/s10681-011-0357-6.)，该特异性片段可作为鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的SCAR标记。本发明优选了315bp的特异性片段作为鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的SCAR标记(SEQ ID No.1)，该片段特异性更强。 

本发明还提供用于鉴定前述SCAR标记或其特异性片段的引物，优选的引物为： 

正向引物5’-AAGTGGCCGCCCTTGCTCAATTT-3’(SEQ IDNo.2)； 

反向引物5’-GGTTTGTGTGTGCCCCTGAAGT-3’(SEQ IDNo.3)。 

更进一步，本发明以含恢复基因近等基因系的群体为材料，通过对7256对SSR引物的筛选，从中筛选到得到两对可以用于检测恢复系和棉花三系杂交种的SSR引物：