[发明专利]NPM1基因突变检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是NPM1基因突变检测方法及其试剂盒。

背景技术

NPM1是一种广泛表达的磷蛋白质，其作用为在细胞核与细胞浆之间穿梭，可与ALK、RARα和MLF-1等形成融合基因，参与多种白血病或淋巴瘤的发病。近来，多项研究显示46-62％的正常核型AML患者存在NPM1基因的突变，成为正常核型AML患者最常见的基因突变，而在异常核型AML患者中也有25％以上存在NPM1突变(BLOOD.2006 107：4514-4523；BLOOD.2007 109：874-885)。目前，国际上有报道的NPM1突变类型有30种以上，其中最常见的类型为12号外显子发生4个碱基的重复导致蛋白C端结构改变，A型(TCTG插入)占接近80％，B型(CATG插入)占6％左右，D型(CCTG插入)占6％左右。携带NPM1突变的AML患者表现出NPM1蛋白异常的胞浆内分布(正常情况下分布于细胞核内)，多发生于女性，骨髓原始细胞比例、血LDH、白细胞及血小板计数高于野生型患者，其白血病细胞的CD34呈低表达或缺如。由于NPM1基因具有肿瘤抑制基因的功能，可调节p53信号通路，有学者推测NPM1基因的突变可影响p53信号并进而导致遗传学不稳定性，因此NPM1基因的突变使得AML细胞能够获得其它的遗传学改变。大约40％伴NPM1突变的AML患者可同时检测到FLT3-ITD，不伴有FLT3-ITD而携带NPM1突变(NPM11mut/FLT3-ITDneg)的患者治愈后良好。伴有NPM1突变的AML患者FLT3基因突变(包括ITD和点突变)的检出率大约是NPM1野生型AML患者的2倍。

NPM1基因突变诊断对AML的诊断及分型具有重要临床意义。2007年，美国国立综合癌症网络(NCCN)将NPM1突变诊断作为AML患者检查项目，对于NPM1突变患者具有不同的治疗方案。目前，国内还没有对NPM1基因进行一个大标本量的检测，传统的检测方法只能检测A、B、D即12号外显子发生4个碱基的重复导致蛋白C端结构改变的突变类型。

发明内容

本发明正是针对以上技术问题，自行设计了PCR扩增引物和测序引物，并研制了一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的NPM1基因突变检测方法及其试剂盒。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明提供NPM1基因突变检测方法，包括以下步骤：

(e)提取待检样本的DNA；

(f)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；

(g)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；

(h)将步骤(c)中的测序结果与标准NPM1基因12号外显子开放阅读框进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。

本发明根据人5号染色体基因组序列登录号：NT_023133.13设计NPM1基因12号外显子开放阅读框相关引物如下，

NPM1基因12号外显子开放阅读框PCR扩增引物：

NPM1F：5’-TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3’(NT_023133.13：15648494～15648515)；

NPM1R：5’-CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3’(NT_023133.13：15648943～15648964)；

NPM1基因12号外显子开放阅读框测序反应引物：

NPM1R2：5’-GGACAGCCAGATATCAACT-3’(NT_023133.13：15648899～15648917)。

本发明还提供NPM1基因突变检测试剂盒，包括：PCR Amplification Mixture；Primer(sense，antisense)、HotStarTaq酶、消化酶、Sequencing Mixture。